謝萬福，王 佳，郭 凱，徐高峰，李傳坤，王茂德

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061)

腦膠質(zhì)瘤是一種最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率高，復(fù)發(fā)率高，死亡率高，大多數(shù)患者在確診1年內(nèi)死亡。雖然在過去的20年中，手術(shù)、放療和化療均取得較大的進步，但是膠質(zhì)瘤的預(yù)后并沒有明顯的改善。因此，在手術(shù)基礎(chǔ)上尋找其他有效的治療方法成為治療膠質(zhì)瘤的重要突破口。目前研究認(rèn)為膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展機制主要是由于癌基因的激活和抑癌基因的失活導(dǎo)致腫瘤細胞增殖失控和凋亡缺陷，進而形成腫瘤。其中，C-erbB2基因的表達在腫瘤發(fā)生過程中的作用已得到越來越多的重視。研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤中C-erbB2基因的高表達激活了凋亡的抑制劑絲氨酸激酶(AKT)，引發(fā)細胞去凋亡化的發(fā)生[1-2]。另有研究報道，C-erbB2基因被抑制后，腫瘤細胞出現(xiàn)明顯的凋亡效應(yīng)，并且細胞凋亡的發(fā)生呈時間依賴性，同時使細胞的增殖活性降低[3]。因此，探索如何抑制膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因表達和增加抑癌基因的表達，對于膠質(zhì)瘤的早期預(yù)防和臨床治療具有重要的價值[4]。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域[5]。本實驗擬采用封閉人C-erbB2基因表達的shRNA表達載體pGenesil-erbB2導(dǎo)入靶細胞BT325細胞內(nèi)，從而通過不同的方法觀察mRNA干擾對BT325細胞生物學(xué)行為的影響，并為進一步開展臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細胞株人膠質(zhì)瘤細胞株BT325由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實驗室提供。

1.2主要試劑本研究中所使用的載體pGenesil質(zhì)粒和感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自武漢市晶賽生物工程技術(shù)有限公司，DNA連接酶及緩沖液均購自New England Biolabs公司，凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化技術(shù)有限公司，C-erbB2單克隆抗體購自北京中山生物試劑公司。本實驗所用相關(guān)基本試劑及實驗耗材均購自西安交通大學(xué)實驗耗材供應(yīng)中心，無菌臺、培養(yǎng)箱、電泳儀、熒光顯微鏡等儀器均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實驗室提供。

1.3方法

1.3.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 以人C-erbB2 cDNA基因為靶標(biāo)的引物設(shè)計，選取人C-erbB2 cDNA基因中的172-2260核苷酸為靶標(biāo)，設(shè)計兩條寡核苷酸片段。序列如下：寡核苷酸序列：BamHⅠ酶切位點5′-GATCCCGGAAACCTGGAACTCACCTACTTCAAGAGAGTAGGTGAGTTCCAGGT-TTCCTTTTTTGGAAA-3′，3′-GGCCTTTGGACC-TTGAGTGGATGAAGTTCTCTCATCCACTCAA-GGTCCAAAGGAAAAAACCTTTTCGA-5′HindⅢ酶切位點；陰性對照寡核苷酸序列：5′-GATCCAAGCTTCATAAGGCGCATAGCTTCAAGAG-AGCTATGCGCCTTATCAAGCTTTTTTTTGG-AAA-3′，3′-GTTCGAACTATTCCGCGTATCGA-AGTTCTCTCGATACGCGGAATAGTTCGAAA-AAAAACCTTTTCGA-5′。將合成的兩條寡核苷酸片段用TE緩沖液(pH 8.0)稀釋成0.05 nmol/μL。分別取5 μL混勻，沸水中放置10 min，緩慢冷卻至室溫，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ笕【€性化的pGenesil-1質(zhì)粒片段2 μL，兩條寡核苷酸片段退火所得的產(chǎn)物2 μL，T4連接酶0.5 μL，T4連接酶緩沖液1 μL，H2O 4.5 μL，16 ℃連接過夜。以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，鋪于含卡那霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。提取質(zhì)粒，將提取的重組質(zhì)粒pGenesil-erbB2和pGenesil-GHK同時用8 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，進行初步判斷后將搖出的菌液送往北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序鑒定。

1.3.2細胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與鑒定 將含細胞的凍存管從液氮罐中取出直接投入37 ℃溫水中，待融化后將凍存管轉(zhuǎn)移至無菌臺中操作，進行換液、傳代。通過LipofectAMINETM2000法，將pGenesil-erbB2、pGenesil-GHK穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入BT325細胞，48 h后加入適量G418進行篩選，兩周后出現(xiàn)多個單細胞集落，將混合集落擴大培養(yǎng)，凍存?zhèn)溆?。將未轉(zhuǎn)染的BT325細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)入pGenesil-erbB2的BT325細胞置于熒光顯微鏡下觀察，并分別制作細胞爬片，DAB顯色后照相并進行灰度分析及RT-PCR檢測。之后分別提取未轉(zhuǎn)染的BT325細胞，并將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-erbB2的BT325細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-GHK的BT325細胞的總蛋白進行蛋白雜交檢測。

1.3.3γ射線照射后BT325細胞的存活率 取對數(shù)生長期的未轉(zhuǎn)染BT325細胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-erbB2的BT325細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pGenesil-GHK的BT325細胞，分別制備成單細胞懸液。根據(jù)不同的照射劑量(照射劑量分為：8、6、4、2、1、0 Gy)分別將細胞株接種至直徑為6 cm的培養(yǎng)皿。將上述0～8 Gy各組培養(yǎng)皿放在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。待細胞完全貼壁后進行γ射線照射，照射結(jié)束后，將上述培養(yǎng)皿移至37 ℃培養(yǎng)箱中，開放培養(yǎng)10 d，10 g/L結(jié)晶紫染色計數(shù) (大于50個細胞的細胞集落算作一個克隆)。統(tǒng)計結(jié)果并計算出BT325細胞的存活曲線。

1.3.4將pGenesil-erbB2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入BT325細胞后細胞周期的檢測 將對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染的和未轉(zhuǎn)染的BT325細胞接種于6孔平底細胞培養(yǎng)板中，每孔細胞接種的濃度為1×105/mL，每孔總液量2 mL。轉(zhuǎn)染48 h后，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后，分別收集每孔細胞。用4 ℃預(yù)冷的0.01 mol/L的PBS洗滌2次(800 r/min，8 min)，棄上清液，加4 ℃預(yù)冷的750 mL/L乙醇固定過夜，再次離心后棄上清液，用0.01 mol/L PBS洗滌一次(800 r/min，8 min)，棄上清液，每孔加RNase(10 mg/mL)100 μL，室溫孵育10 min。每孔細胞加PI(100 μg/mL)染液100 μL，37 ℃避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測。每個樣品取1×104個細胞，細胞在488 nm處被氬激光激發(fā)，PI的紅色熒光通過630 nm濾光片收集，結(jié)果用B-D FAC Sort Cell Quest軟件做DNA分析。

1.3.5將pGenesil-erbB2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入BT325細胞后細胞凋亡的檢測 用去離子水按1∶4稀釋結(jié)合緩沖液，以4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，用250 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，使其細胞濃度為1×105/mL。加100 μL的細胞懸液入5 mL流式管中，每管加入5 μL Annexin V/FITC和5 μL 20 μg/mL的碘化丙錠，避光混勻，標(biāo)記15 min。對照不加Annexin V作校正因子，在反應(yīng)管中加入400 μL PBS。用流式細胞儀(FACS)檢測，光源為488 nm氬離子激光器。

1.3.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件，進行t檢驗。Real-time PCR結(jié)果應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用One-way ANOVA(單因素方差分析)進行各組間的比較，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1成功構(gòu)建人C-erbB2基因shmRNA質(zhì)粒挑選克隆經(jīng)測序分析確認(rèn)插入序列正確，表明pGenesil-erbB2中已含有shRNA模板DNA片段。陽性重組質(zhì)粒送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序鑒定，結(jié)果說明成功構(gòu)建了C-erbB2基因shRNA表達質(zhì)粒(圖1)。

圖1構(gòu)建的pGENESIL-erbB2質(zhì)粒測序圖

Fig.1 Sequence diagram of pGENESIL-erbB2

2.2pGenesil-erbB2和pGenesil-GHK穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入BT325細胞熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)未見熒光，而轉(zhuǎn)染pGenesil-erbB2后的BT325細胞熒光顯著。說明pGenesil-erbB2成功轉(zhuǎn)染入BT325細胞(圖2)。

圖2質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染后的熒光照片

Fig.2 Fluorescent images of BT325 cells after the transfection of pGenesil-erbB2

A：對照組BT325細胞；B：轉(zhuǎn)染pGenesil-erbB2后的BT325細胞。

2.3轉(zhuǎn)染后BT325細胞的免疫組織化學(xué)鑒定C-erbB2蛋白主要分布在胞質(zhì)內(nèi)，空白對照組未轉(zhuǎn)染的BT325細胞的灰度明顯強于轉(zhuǎn)染后的實驗組pGenesil-erbB2-BT325細胞，說明經(jīng)過轉(zhuǎn)染后，C-erbB2目的蛋白含量明顯下調(diào)(P<0.01)。同時形態(tài)學(xué)觀察可見，轉(zhuǎn)染后大部分細胞凋亡壞死，細胞形態(tài)破損?；叶戎禉z測表明pGenesil-erbB2轉(zhuǎn)染48 h后，C-erbB2蛋白表達明顯降低(圖3)。

2.4未轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后BT325細胞內(nèi)C-erbB2目的蛋白的表達從實驗組pGenesil-erbB2-BT325中目的蛋白的表達可以看出，RNAi組的蛋白表達量與對照組pGenesil-GHK-BT325和未轉(zhuǎn)染BT325相比較，表達量明顯降低，說明RNAi的效果比較明顯，C-erbB2蛋白的表達被shRNA所抑制(圖4)。吸光度分析顯示相對對照組BT325，p27增加了3.8倍；p53增加了2.5倍；p-p53增加了3.6倍；Bcl-2降低了4.5倍；p-p38增加了3.4倍(P<0.05)；p38無顯著性差異(P>0.1)(圖5)。

圖3pGenesil-erbB2轉(zhuǎn)染48h后C-erbB2蛋白表達量的變化

Fig.3 The expression of C-erbB2 protein at 48 h after the transfection of pGenesil-erbB2

A：BT325細胞轉(zhuǎn)染前C-erbB2的表達情況；B：BT325細胞轉(zhuǎn)染后C-erbB2的表達情況。

圖4pGenesil-erbB2轉(zhuǎn)染后對BT325細胞目的蛋白表達的Westernblot分析

Fig.4 Western blot analysis of the effect of pGenesil-erbB2 on the expression of target protein in BT325 cells

1：BT325細胞組；2：pGenesil-GHK-BT325細胞組；3：pGenesil-erbB2-BT325細胞組。

2.5未轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后BT325細胞內(nèi)C-erbB2目的基因mRNA的表達從實驗組pGenesil-erbB2-BT325中目的基因的mRNA的表達來看，轉(zhuǎn)染組的C-erbB2 mRNA表達量與對照組pGenesil-GHK-BT325和未轉(zhuǎn)染BT325相比較，表達量明顯降低，說明RNAi的效果比較明顯，C-erbB2基因的表達被shRNA所抑制(圖6)。同時進行mRNA吸光度分析，相對未轉(zhuǎn)染的BT325細胞，C-erbB2降低了8.3倍，p27增加了2.8倍，p53增加了2.7倍，Bcl-2降低了3.7倍(圖7)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5pGenesil-erbB2轉(zhuǎn)染后對BT325細胞目的蛋白表達的吸光度分析

Fig.5 Ratios of the absorbance of effect of pGenesil-erbB2 on the expression of target protein in BT325 cells

圖6pGenesil-erbB2對BT325細胞C-erbB2mRNA表達的影響

Fig.6 RT-PCR analysis of the effect of pGenesil-erbB2 on the expressions of C-erbB2 in BT325 cells

1：Marker；2：pGenesil-erbB2-BT325細胞組；3：BT325細胞組；4：pGenesil-GHK-BT325細胞組。

圖7pGenesil-erbB2轉(zhuǎn)染后對BT325細胞C-erbB2，Bcl-2，p53，p27mRNA表達的影響

Fig.7 Ratios of the absorbance of effect of pGenesil-erbB2 on the expressions of C-erbB2, Bcl-2, p53 and p27 in BT325 cells

2.6將pGenesil-erbB2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入BT325細胞后對細胞周期的影響應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞周期，結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染BT325細胞組和陰性對照pGenesil-GHK-BT325細胞組之間的各細胞周期時相變化較小，G1/G0期細胞占絕大多數(shù)，分別為71.75%和70.89%；實驗組細胞pGenesil-erbB2-BT325的G1/G0期細胞顯著減少(P<0.05)，S期細胞大量增加(P<0.05)，其中G1/G0期細胞僅占44.01%，而S期細胞占到51.15%(圖8)。

2.7將pGenesil-erbB2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入BT325細胞后對細胞凋亡的影響應(yīng)用Annexin V+PI流式細胞儀檢測法獲得的結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染BT325細胞組和陰性對照pGenesil-GHK-BT325細胞組各時相之間沒有顯著差別，變化較少。細胞實驗組pGenesil-erbB2-BT325組比未轉(zhuǎn)染BT325細胞組和陰性對照pGenesil-GHK-BT325細胞組的正常細胞大量減少(P<0.05)，早凋亡細胞和晚凋亡細胞明顯增加(P<0.05)(圖9)。

圖8pGenesil-erbB2轉(zhuǎn)染后BT325細胞周期的變化

Fig.8 Changes in cell cycle of BT325 cells after the transfection of pGenesil-erbB2

A：BT325細胞組；B：pGenesil-GHK-BT325細胞組；C：pGenesil-erbB2-BT325細胞組。

圖9pGenesil-erbB2轉(zhuǎn)染對BT325細胞凋亡的影響

Fig.9 Effects of the transfection of pGenesil-erbB2 on apoptosis of BT325 cells

A：BT325細胞組；B：pGenesil-GHK-BT325細胞組；C：pGenesil-erbB2-BT325細胞組。

2.8pGenesil-erbB2轉(zhuǎn)染后BT325細胞對γ射線的敏感性增加集落形成法劑量-細胞存活曲線結(jié)果顯示，經(jīng)處理后平均致死劑量(D0)降低，存活曲線肩區(qū)(Dq)變小，說明pGenesil-erbB2對腦膠質(zhì)瘤細胞BT325有放射增敏作用(圖10)。

3 討 論

C-erbB2主要通過影響p53，p38，p27，Bcl-2等基因片段的表達以調(diào)控細胞周期和凋亡機制，其中以p53及Bcl-2尤為顯著。目前，對于p53的研究發(fā)現(xiàn)，野生型P53可控制G1細胞進入S期，故其對于抑制異常細胞增殖和腫瘤的發(fā)生具有重要意義[6]。當(dāng)P53基因突變后不僅會喪失抑癌作用，而且還有促進腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化的作用[7]。Bcl-2抑癌基因具有抑制細胞丟失、阻止細胞凋亡等功能，對各種原因引起的細胞凋亡均具有抑制作用[8]。

圖10pGenesil-erbB2轉(zhuǎn)染后BT325細胞的存活曲線

Fig.10 Survival curve of BT325 cells after the transfection of pGenesil-erbB2

經(jīng)過前期實驗，結(jié)果表明C-erbB2在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中差異表達，且篩選出了C-erbB2表達量最高的BT325細胞作為研究的靶細胞，同時成功構(gòu)建了封閉人C-erbB2基因表達的shRNA表達載體pGenesil-erbB2。本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用C-erbB2 shRNA構(gòu)建質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染篩選出的高表達C-erbB2蛋白的細胞株BT325，經(jīng)過免疫組化染色、Western blot、RT-PCR及流式細胞儀檢測等方法觀察抑制C-erbB2基因表達對于膠質(zhì)瘤細胞生長、凋亡的影響，并聯(lián)合γ射線照射來探索以C-erbB2作為靶點的抗癌治療及聯(lián)合放療的預(yù)期效果。

實驗中通過免疫組化形態(tài)學(xué)觀察可見，經(jīng)轉(zhuǎn)染后大部分腫瘤細胞出現(xiàn)凋亡壞死，細胞形態(tài)破損，細胞結(jié)構(gòu)完全破壞。Western blot結(jié)果表明細胞內(nèi)C-erbB2蛋白表達下降后，Bcl-2表達明顯下降，p53、p-p53、p-27、p-p38等抑癌基因表達顯著增加。RT-PCR結(jié)果表明，在細胞內(nèi)C-erbB2 mRNA表達下降后，Bcl-2 mRNA表達顯著減少，而p53和p27 mRNA表達明顯上調(diào)，這與C-erbB2在胃癌中的相關(guān)研究結(jié)果相符合[9-10]。而流式細胞儀檢測細胞凋亡證明干擾處理組細胞早凋亡細胞是空白對照組(BT325)的15.2倍，晚凋亡是空白對照組的12.7倍，壞死細胞是空白對照組的1.9倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細胞周期檢測證明干擾后G1/G0期和G2/M期細胞明顯減少，S期細胞增加了5.8倍，這些與KUMARI N在2012年及AKSU G等人在2011年報道的C-erbB2在膽囊癌及胸部腫瘤中的研究結(jié)果相一致[11-12]。因此，研究結(jié)果證明構(gòu)建的載體pGenesil-erbB2通過對Bcl-2 mRNA的干擾作用，有效的降低了Bcl-2的表達，并通過上調(diào)p53 mRNA和p27 mRNA，顯著增加了p53、p-p53和p-27的表達，加速了腫瘤細胞的凋亡，并減少了其處于分裂期細胞的比例，從而抑制了膠質(zhì)瘤細胞BT325的生長及分裂，一定程度上減少了腫瘤的發(fā)生。

經(jīng)γ射線照射后BT325細胞的存活率結(jié)果表明，經(jīng)pGenesil-erbB2轉(zhuǎn)染后BT325細胞的平均致死劑量(D0)降低，存活曲線肩區(qū)(Dq)變小。進一步證明了在基因?qū)用嫔贤ㄟ^轉(zhuǎn)染pGenesil-erbB2抑制了C-erbB2的表達后，膠質(zhì)瘤BT325細胞對γ射線的敏感程度明顯上升。因此，pGenesil-erbB2質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染有明顯的放射增敏作用，可顯著增加γ射線對膠質(zhì)瘤細胞的殺傷能力。

綜上所述，本研究證明以C-erbB2為靶向的shRNA可以有效的抑制C-erbB2的表達，并可能通過抑制相關(guān)癌基因表達和增加抑癌基因的表達來誘導(dǎo)BT325細胞的凋亡；通過分析C-erbB2對膠質(zhì)瘤細胞增殖的作用，闡明C-erbB2對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機制，為膠質(zhì)瘤的早期預(yù)防和臨床治療提供更充分的理論依據(jù)；探討以C-erbB2作為靶點的抗癌治療及聯(lián)合γ射線放療的效果，可能成為C-erbB2治療的一個新的突破口，為臨床上腦膠質(zhì)瘤的早期預(yù)防和基因治療開辟一條新的途徑，預(yù)期具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。

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