王 鑫，耿希剛，譚云鶴，潘龍毅，徐 濤，鐘守平，李廣順

(1. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管外科，陜西西安 710061；2. 西安市中心醫(yī)院 心胸外科，陜西西安 710003；3. 西安市中心醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710003)

體外循環(huán)的建立保障了心臟外科手術(shù)的順利進(jìn)行，而由此導(dǎo)致的心肌細(xì)胞短暫缺血及缺血再灌注損傷成為研究的重要課題。近年來，干細(xì)胞移植應(yīng)用于心肌損傷的治療成為熱點(diǎn)，但因異體移植存在風(fēng)險(xiǎn)[1]，動(dòng)員自體干細(xì)胞遷移治療則成為可行的辦法。本研究就是利用粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF)動(dòng)員干細(xì)胞系，探討其對心肌缺血再灌注損傷的早期影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、藥品及試劑SD大鼠30只(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(瑞白，齊魯制藥廠)；大鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；RNA提取試劑盒(Fast200，上海飛捷生物技術(shù)有限公司)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國MBI公司)；2×PCRmix(西安潤德生物技術(shù)公司)；100 bp DNA ladder marker(廣州東盛生物技術(shù)公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及造模 30只SD大鼠，體質(zhì)量(270±30)g，隨機(jī)分為：假手術(shù)組(8只)、對照組(11只)及動(dòng)員組(11只)。造模前1周，給予動(dòng)員組大鼠腹腔注射G-CSF 50 μg/(kg·d)[2]，共7 d。造模參照張新寧等[3]報(bào)道的方法。假手術(shù)組：行開胸手術(shù)后于左冠脈前降支穿過縫線不結(jié)扎。對照組：行開胸手術(shù)后于左冠脈前降支穿過縫線并做活結(jié)結(jié)扎，30 min后再去除結(jié)扎線灌注120 min。動(dòng)員組：于手術(shù)前1周給予連續(xù)腹腔注射7 d，之后處理同對照組。造模后24 h各組最終存活大鼠數(shù)量均為8只。

1.2.2血液標(biāo)本的采集 動(dòng)員組G-CSF動(dòng)員7 d后采集各組血常規(guī)指標(biāo)；建模后24 h采集各組心肌酶譜指標(biāo)。采集的標(biāo)本后置入全自動(dòng)血生化分析儀，記錄所得數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3組織標(biāo)本的制備 麻醉后處死大鼠，立即取出心臟。①組織切片：用PBS液沖洗，浸入固定液，石蠟常規(guī)包埋并切片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。②RT-PCR：用經(jīng)DEPC處理的PBS液反復(fù)沖洗干凈，用RNA酶滅活的刀剪取心前區(qū)缺血再灌注區(qū)域，立即置入-80 ℃液氮保存。

1.2.4ELISA法檢測血清VEGF 造模后24 h采取各組大鼠外周血300 μL，5 000 r/min離心30 min，吸取表面血清并保存在-20 ℃冰箱。按照試劑盒說明進(jìn)行操作，在492 nm處獲得相應(yīng)吸光度值(A)并統(tǒng)計(jì)。

1.2.5RT-PCR法檢測目的基因 本實(shí)驗(yàn)共包含兩部分，第一部分為組間比較：各組Sca-1、CD34、CTnI、Bcl-2基因在造模后24 h的表達(dá)情況；第二部分為組內(nèi)比較：即動(dòng)員組中CD34及Sca-1基因在注射前、造模前、造模后24 h不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況。按試劑盒說明提取組織標(biāo)本RNA，并得到cDNA產(chǎn)物，按照94 ℃變性3 min，進(jìn)入循環(huán)：94 ℃ 30 s，Tm 30 s，72 ℃ 30 s。目的基因共35個(gè)循環(huán)，內(nèi)參20個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸10 min。其中目的基因CD34(5′-TTCCCGAAAGACTCTGATTG-3′，5′-ACCATTCTCCGTGTAATAAGG-3′；145 bp；Tm：62 ℃)、Sca-1(5′-GGCAGCAGACACAGATACG-3′，5′-CCGACCACCTCCTCTTCC-3′；175 bp；Tm：60 ℃)、Bcl-2(5′-GCAGAGATGTCCAGTCAG-3′，5′-GCCATATA-

GTTCCACAAAGG-3′；273 bp；Tm：60 ℃)、CTnI(5′-GCCAACTACCGAGCCTATGC-3′，5′-CTTCAAA-GCCCAGCCCATCC-3′；205 bp；Tm：62 ℃)及內(nèi)參GAPDH(5′-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3′；233 bp，Tm：60 ℃)

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較采用方差分析并行方差齊性檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)兩兩之間比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1血清學(xué)指標(biāo)

2.1.1血常規(guī)檢測結(jié)果 WBC值經(jīng)方差分析(F=160.01，P<0.05)3組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中，動(dòng)員組較其他兩組有所升高(P<0.05)，而假手術(shù)組與對照組則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.322)。其他指標(biāo)HGB(F=1.876，P=0.178)、RBC(F=0.081，P=0.923)以及PLT(F=0.142，P=0.868)3組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

表1動(dòng)員組G-CSF動(dòng)員7d后各組血常規(guī)指標(biāo)的比較

Tab.1 Blood routine test results in each group

(n=8,

與假手術(shù)組及對照組比較，*P<0.05。

2.1.2心肌酶譜的檢測結(jié)果 建模后24 h各組心肌酶譜相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)如表2所示。3組間3個(gè)指標(biāo)方差分析的結(jié)果CK：F=1 136.295，P<0.01；CK-MB：F=1 721.238，P<0.01；CTnI：F=1 204.033，P<0.01，說明這3個(gè)指標(biāo)在3組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步兩兩比較顯示，動(dòng)員組及對照組各個(gè)指標(biāo)較假手術(shù)組增高(P<0.05)；但動(dòng)員組較對照組各心肌酶譜指標(biāo)是降低的(P<0.05)。

表2建模后24h各組心肌酶譜檢測指標(biāo)的比較

組 別CKCK-MBCTnI假手術(shù)組271.38±29.69233.00±19.710.58±0.04對照組3730.13±194.06*2889.13±136.88*25.91±1.63*動(dòng)員組2850.75±172.38*△2003.50±78.93*△16.16±0.76*△

n=8；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05。

2.2組織切片結(jié)果由圖1可見，正常的心肌組織結(jié)構(gòu)為條索狀平滑肌構(gòu)成，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)結(jié)合緊密，胞質(zhì)染色均勻(圖A)。對照組(圖B)心肌細(xì)胞整體腫脹，胞質(zhì)出現(xiàn)裂紋，胞質(zhì)松散；細(xì)胞核與胞質(zhì)出現(xiàn)分離，甚至部分細(xì)胞核出現(xiàn)溶解；心肌纖維之間的聯(lián)系出現(xiàn)斷裂。動(dòng)員組(圖C)較對照組胞質(zhì)松散相對減少，核質(zhì)連接較為緊密，且胞質(zhì)近細(xì)胞核處染色均勻。

2.3各組VEGF的表達(dá)情況假手術(shù)組、對照組、動(dòng)員組VEGF的表達(dá)分別為：(39.45±9.68)pg/mL、(47.86±5.45)pg/mL、(66.95±8.28)pg/mL，經(jīng)方差分析，3組間VEGF的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=24.804，P<0.01)。進(jìn)一步兩兩比較,動(dòng)員組較假手術(shù)組、對照組VEGF含量高(P<0.05)，而假手術(shù)組、對照組之間尚不能肯定有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.048)。

圖1各組大鼠心肌組織的變化

Fig.1 Changes of rat myocardial tissues (HE, ×400)

A：假手術(shù)組；B：對照組；C：動(dòng)員組。

2.4RT-PCR檢測結(jié)果

2.4.1RT-PCR比較3組之間各項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá) 由圖2可以看出，對照組及動(dòng)員組各目的基因均較假手術(shù)組表達(dá)增高。運(yùn)用凝膠分析軟件Labworks進(jìn)行半定量分析，選取累計(jì)吸光度(IA)值為指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3所示。3組間目的基因經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD34：F=43.26，P<0.01；Sca-1：F=26.33，P<0.01；CTnI：F=14.56，P<0.01；Bcl-2：F=216.91，P<0.01。進(jìn)一步兩兩比較得知：CD34在假手術(shù)組、對照組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.565)，而動(dòng)員組較假手術(shù)組、對照組表達(dá)增高(P<0.05)；CTnI在對照組表達(dá)較假手術(shù)組、動(dòng)員組降低(P<0.05)，但假手術(shù)組、動(dòng)員組兩組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.37)；Sca-1在動(dòng)員組及對照組較假手術(shù)組表達(dá)增高(P<0.05)，而Bcl-2在動(dòng)員組較對照組表達(dá)增高(P<0.05)。

圖2RT-PCR檢測各組相關(guān)目的基因的表達(dá)

Fig.2 The expression of target genes in each group (RT-PCR)

表3各組目的基因累計(jì)吸光度平均值的比較

目的基因假手術(shù)組對照組動(dòng)員組CD348120.90±821.418378.80±306.4311657.67±200.52*△Sca-1526.75±28.541089.75±158.47795.18±34.31*CTnI95418.67±7263.1670973.00±4390.1390754.67±5664.68△Bcl-2840.22±29.962115.49±102.712592.37±150.34△

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P<0.05。

2.4.2G-CSF動(dòng)員后動(dòng)員組CD34、Sca-1在不同時(shí)間點(diǎn)的變化 動(dòng)員組CD34和Sca-1在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有所表達(dá)(圖3)。半定量分析結(jié)果顯示，兩種目的基因在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CD34：F=26.082，P<0.05；Sca-1：F=22.205，P<0.05。兩兩比較得知：CD34在注射前的表達(dá)最低(P<0.05)。而其他兩個(gè)檢測時(shí)間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而Sca-1在造模后24 h的表達(dá)最高(P<0.05)，注射前與造模前的IOD值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后(P=0.055)，尚不能認(rèn)為兩者的表達(dá)存在差異(表4)。

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷的治療可以通過血管再生、增加局部灌注、減少細(xì)胞壞死的途徑，這其中就包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)[4]等。也可動(dòng)員干細(xì)胞到外周血，利用歸巢促進(jìn)其向損傷的心肌細(xì)胞遷移，從而修復(fù)細(xì)胞[5]。干細(xì)胞動(dòng)員可通過外界因素的干預(yù)或者自身機(jī)體的代償機(jī)制促使干細(xì)胞遷移，從而使得外周血干細(xì)胞數(shù)量增加。本研究就是應(yīng)用G-CSF作為刺激因子[6-7]，探討其對早期心肌缺血再灌注損傷的影響。建模開始前，我們先給予動(dòng)員組連續(xù)7d G-CSF注射，結(jié)果動(dòng)員組的白細(xì)胞較其他兩組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[8]；為進(jìn)一步證實(shí)，我們又從基因?qū)用娣治鰟?dòng)員組CD34與Sca-1在注射前和注射后7 d的表達(dá)，結(jié)果顯示G-CSF注射后CD34[9]與Sca-1表達(dá)是增高的，從而證實(shí)G-CSF確實(shí)有動(dòng)員干細(xì)胞的作用[2]。建模后24 h，我們先采集血樣分析心肌酶譜，結(jié)果提示動(dòng)員組較對照組心肌酶譜指標(biāo)下降，說明G-CSF的干預(yù)可減少心肌細(xì)胞的凋亡。而組間行Bcl-2[10]表達(dá)的比較則證明G-CSF的動(dòng)員的確有抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用，從而減少了血清中的CTnI含量，提高了其細(xì)胞中的含量(動(dòng)員組高于對照組表達(dá)量，P<0.05)。由于G-CSF有動(dòng)員干細(xì)胞的作用，我們檢測了CD34與Sca-1在組間的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD34在假手術(shù)組及對照組間表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中對照組IOD值較假手術(shù)組高，提示因局部組織損傷是可以引發(fā)自身代償機(jī)制動(dòng)員干細(xì)胞系的；但動(dòng)員組較其他兩組CD34表達(dá)明顯升高，說明預(yù)注射細(xì)胞因子有明顯的動(dòng)員干細(xì)胞系作用，而因損傷靠自身代償動(dòng)員干細(xì)胞系是需要一定時(shí)間的；Sca-1是較為公認(rèn)干細(xì)胞系細(xì)胞表面標(biāo)志物的一個(gè)指標(biāo)，盡管本實(shí)驗(yàn)中半定量分析看出動(dòng)員組及對照組Sca-1較假手術(shù)組有所增加，提示有干細(xì)胞的動(dòng)員，但在表達(dá)增高的兩組中，動(dòng)員組Sca-1表達(dá)量相對低，考慮可能與實(shí)驗(yàn)樣本量少，Sca-1自身表達(dá)量低相關(guān)，尚需加大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。VEGF的高表達(dá)是治療組織損傷的一個(gè)途徑，它對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及血管重建有著重要的意義[11]。而干細(xì)胞修復(fù)組織的形式中包含自身分泌的細(xì)胞因子對損傷組織的影響[12]，這其中就包含VEGF。我們發(fā)現(xiàn)動(dòng)員組在CD34及Sca-1均高表達(dá)的同時(shí)，VEFG的含量較其他兩組也是明顯增加的。說明動(dòng)員的干細(xì)胞系可能存在旁分泌修復(fù)作用。G-CSF不僅能動(dòng)員干細(xì)胞系，同時(shí)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)G-CSF的刺激可提高VEFG水平[13]。因此，可以推斷，G-CSF的預(yù)動(dòng)員對心肌缺血再灌注損傷的早期修復(fù)可能有雙重保護(hù)作用，但需進(jìn)行更加深入的研究。本研究初步證實(shí)了應(yīng)用G-CSF可提前動(dòng)員機(jī)體內(nèi)的干細(xì)胞系，從而減輕心肌缺血再灌注早期的損傷程度，進(jìn)一步減少心室重構(gòu)，改善心功能。

圖3RT-PCR檢測動(dòng)員組CD34、Sca-1不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)

Fig.3 The expression of CD34 and Sca-1 in mobilization group

表4動(dòng)員組組內(nèi)CD34、Sca-1的累計(jì)吸光度均值的比較

基 因注射前造模前造模后24hCD3418536.00±2713.4541223.33±3476.67*36074.67±5419.15*Sca-12865.57±281.613410.23±237.184376.60±319.06△

與注射前比較，*P<0.05；△P<0.05。

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