薄雙玲，馬太芳，白慧健，宋小峰，田 鶴

(1.山西醫(yī)科大學汾陽學院組織胚胎學教研室，山西汾陽 032200； 2.遼寧醫(yī)學院組織胚胎學教研室，遼寧錦州 121001)

去整合素金屬蛋白酶9(a disintegrin and metalloproteinase 9, ADAM9)是ADAM家族的重要成員之一，功能活躍，廣泛表達于各種組織，具有多種生物活性。ADAM9主要通過胞外域脫落、基質(zhì)降解和細胞接觸來發(fā)揮作用，有多種配體，涉及不同信號通路及信號分子，從而調(diào)節(jié)胞內(nèi)信號傳導過程[1]。ADAM9參與了多種生理和病理過程[1-3]。YAN等人已報道了ADAM9在發(fā)育小雞的脊髓、耳蝸、晶狀體等處的表達情況[4-5]，然而關于ADAM9與小鼠腎發(fā)育方面的研究尚少見報道。本研究采用免疫組織化學技術結(jié)合體視學方法及免疫印跡法檢測ADAM9 在小鼠腎發(fā)育中的時空表達及其含量變化,從而探討ADAM9 與腎分化發(fā)育的關系。

1 材料與方法

1.1組織取材及標本制備成年健康昆明系小白鼠雌、雄(1∶1)同窩飼養(yǎng)，每日早晚8∶00時檢查雌鼠妊娠情況，以觀察到陰道栓脫落的最早時間計為胚齡(embryonic days, E)0 d。孕鼠分籠飼養(yǎng)2周后，每日早晚8∶00時觀察其生產(chǎn)情況，以觀察到仔鼠出生的最早時間計為生后(postnatal, P)0 d。孕鼠共分為10組，每組4只，從每只孕鼠取2只胎鼠或仔鼠，分別取胚齡11、14、16、18 d胎鼠和生后1、3、7、14、28、40 d仔鼠腎。孕鼠經(jīng)0.1 g/mL水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，胚齡11 d胎鼠全胚固定，胚齡14、16、18 d胎鼠取其左腎固定；仔鼠0.1 g/mL水合氯醛麻醉后，經(jīng)腹后壁取出左腎，用排刀法沿橫軸將腎切開，入0.04 g/mL多聚甲醛固定，常規(guī)脫水透明，石蠟定向包埋，做厚5 μm連續(xù)切片。右腎均入液氮迅速冷凍，-85 ℃保存，供免疫印跡法測定用。

1.2試劑兔抗小鼠ADAM9多克隆抗體由上海凱博生化試劑有限公司提供；Post Vaccination(PV)兔試劑盒由中杉金橋生物技術有限公司提供；Polyvinylidene Fluoride(PVDF)膜、Bovine Serum Albumin(BSA)、Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)、Nitro-Blue-Tetrazolium/5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate(NBT/BCIP)、Tween-20、Phenylmethanesulfonylfluoride(PMSF)均由Sigma公司提供。

1.3免疫組織化學染色、灰度評分及體視學測定石蠟切片脫蠟至水后微波修復10 min，加0.3 g/mL H2O2室溫孵育10 min，滴加兔抗小鼠ADAM9一抗(1∶100)4 ℃過夜，生物素標記的羊抗兔二抗，37 ℃孵育30 min，SABC 37 ℃孵育30 min，DAB-H2O2顯色，蘇木精復染。用PBS代替一抗作陰性對照。細胞質(zhì)呈棕黃色為ADAM9的陽性表達。

免疫組織化學結(jié)果采用CIAS-1000細胞圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析。每個標本取5張切片，在400倍光鏡下，每張切片“S”形隨機選取5個陽性視野，以切片背景色為參照，對腎小體、腎小管進行分析。以灰度值來表示ADAM9的表達量，灰度值越大，ADAM9表達量越少。

每個標本取5張切片,在油鏡下按“S”形選取5個視野，采用方格測試系統(tǒng)，交點計數(shù)法分別測算腎小體、皮質(zhì)腎小管陽性反應表達的體密度值(volume density),計算公式為Vv =ΣPX/ΣPC，其PX為測試系統(tǒng)落在陽性表達的腎小體或腎小管的點數(shù)，Pc為落在參照系(腎)的點數(shù)。

1.4免疫印跡法取冷凍待用的右腎組織，每組加入4倍體積裂解液，超聲粉碎機粉碎后0 ℃靜置30 min，離心，用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量。每組樣品取25 μg濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。0.05 g/mL脫脂奶粉封閉后與ADAM9抗體(1∶400)4 ℃過夜，堿性磷酸酶標記二抗(1∶700)室溫1 h，BCIP/NBT試劑顯色，用Gene Tools軟件分析電泳條帶吸光度值(A)。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學染色結(jié)果E11 d，ADAM9 即開始在輸尿管芽表達(圖1A)。E14 d表達在逗號小體(Ⅰ期)[6]及S小體(Ⅱ期)的裂隙中(圖1B)。E16 d，在毛細血管袢階段(Ⅲ期)表達微弱。至E18 d，在較成熟階段(Ⅳ、Ⅴ期)的腎小體內(nèi)和早期腎小管中均可見ADAM9表達，而在生腎區(qū)表達較弱。從P1 d至P7 d，在發(fā)育各期腎小體和皮質(zhì)腎小管ADAM9的表達逐漸增強(圖1C)，在髓質(zhì)小血管可見表達(圖1D)。P7 d ADAM9的表達達到高峰之后逐漸減少，但在髓放線沒有表達(圖1E)。P40 d生腎區(qū)消失，ADAM9僅表達于較成熟階段的腎小體中，并趨于穩(wěn)定；在成熟期的皮質(zhì)腎小管ADAM9表達微弱，同時可見小動脈有陽性表達(圖1F)。而其在集合管的表達始終較弱。

2.2免疫組織化學染色灰度評分結(jié)果隨著腎的發(fā)育，ADAM9表達的灰度值在腎小體呈逐漸降低后趨于平穩(wěn)，而腎小管則為先降低后升高的趨勢(圖2)。

2.3體視學測量結(jié)果隨著胚(日)齡的增加，ADAM9在各期腎小體的體密度值逐漸增加，P7 d時達到最大并趨于穩(wěn)定，而在皮質(zhì)腎小管表達的體密度值則呈現(xiàn)先增后減的趨勢(圖3)。

2.4免疫印跡法測定結(jié)果應用Gene Tools軟件對ADAM9蛋白表達的電泳條帶分析顯示，隨著胚(日)齡的增加ADAM9在小鼠腎組織的A值呈先增后減的趨勢(圖4)。

圖1ADAM9在小鼠腎臟組織中的表達

Fig.1 ADAM9 expression in the developing kidney detected by immunohistochemistry

A：E11 d；B：E14 d；C：P1 d；D：P7 d；E：P7 d；F：P40 d(放大倍數(shù)：E為×400，余均為×1 000)

圖2小鼠不同發(fā)育階段ADAM9在腎小體和腎小管表達的灰度值

Fig.2 Gray scale of ADAM9 in the developing renal corpuscles and tubules

與前一組比較，*P<0.05，n=200；A：腎小體的灰度值變化；B：腎小管的灰度值變化。

圖3小鼠發(fā)育各階段腎小體、皮質(zhì)腎小管ADAM9陽性表達的體密度值

Fig.3 Volume density of ADAM9 in the glomeruli and tubules of developing kidneys of mice

與前一組比較，*P<0.05，n=200；A：腎小體的體密度值變化；B：腎小管的體密度值變化。

3 討 論

ADAM9 屬于跨膜蛋白家族，即去整合素(解聚素)金屬蛋白酶家族(a disintegrin and metalloproteinase, ADAM)，這個家族可以通過影響細胞黏附、遷移、蛋白質(zhì)水解和信號轉(zhuǎn)導等，參與多種生理和病理過程。在胚胎發(fā)育中，其主要通過調(diào)控細胞與細胞、細胞與基質(zhì)的粘附參與形態(tài)構(gòu)建和組織形成，尤其與神經(jīng)發(fā)生、細胞遷移、引導軸突生長以及細胞分化等過程密切相關[5]。研究報道在小鼠發(fā)育期的間充質(zhì)、心臟和腦等部位均有ADAM9的高度表達，這提示ADAM9對多種器官的發(fā)育分化都發(fā)揮一定的作用[7]。

圖4小鼠發(fā)育過程中腎內(nèi)ADAM9表達的免疫印跡結(jié)果

Fig.4 Expression of ADAM9 in the developing mouse kidney detected by immunoblot

與前一組比較，*P<0.05，n=8。A：免疫印跡蛋白條帶；B：ADAM9在小鼠腎組織的A值的變化。

為探討ADAM9與腎臟發(fā)育的關系，本實驗通過免疫組織化學技術結(jié)合體視學方法及免疫印跡法檢測ADAM9在小鼠腎發(fā)育中的表達及其含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADAM9在胚胎11 d時即表達于輸尿管芽，這表明ADAM9在輸尿管芽與生后腎組織相互誘導分支過程中，就可能發(fā)揮一定的作用。隨后在各期腎小體及皮質(zhì)迷路腎小管均有表達，且從生后1 d開始在腎小體和腎小管的表達都逐漸增強，生后7 d達到頂峰后腎小體的表達趨于穩(wěn)定，而腎小管的表達則逐漸減弱。這說明ADAM9在腎臟發(fā)育過程中的表達具有一定的時空性，且腎小管的表達主要集中在皮質(zhì)淺層，而較成熟的腎小管的表達卻很弱，故我們認為ADAM9可能與腎小管的發(fā)育成熟有關。ADAM9表達于髓質(zhì)小血管和成熟后小動脈，說明其在胚胎血管生成及成熟血管的維持和構(gòu)建也發(fā)揮一定的作用。根據(jù)文獻報道和本課題組的前期研究證明，后腎發(fā)育開始于胚胎11 d，至生后7 d時生腎區(qū)消失，腎小管和腎小體基本發(fā)育完畢，生后40 d時，小鼠腎臟與成鼠完全相同，這表明ADAM9在腎臟發(fā)育早期作用較大，而在腎臟后期的成熟過程中，作用較弱。

早在1998年，YASUSHI[8]已經(jīng)證實ADAM9形成的復合物調(diào)節(jié)Pro-HB-EGF和HB-EGF(肝素結(jié)合表皮生長因子)釋放，故ADAM9通過生長因子或受體蛋白水解脫落而影響細胞的發(fā)育和分化，適當?shù)纳L因子受體對于正常的胚胎發(fā)育，成體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是必需的。也有研究表明，ADAM9在大鼠腎臟各型去整合素金屬蛋白酶表達中占支配優(yōu)勢，ADAM9廣泛表達于腎小體，腎小管(近端、遠端)的上皮細胞[9-10]，而且與含有β1鏈的整合素蛋白高度共表達，影響整合素與Ⅳ型膠原、層黏連蛋白以及纖維黏連蛋白的相互作用，調(diào)節(jié)細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切。

綜上所述，在ADAM家族中，ADAM9是一個非?；钴S的蛋白酶，可以通過多種途徑發(fā)揮其生理作用，尤其在腎臟發(fā)育過程中，其與細胞發(fā)育分化密切相關，然而關于這一現(xiàn)象的詳細機制還有待于我們進一步的研究。

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