王翔凌，孫寧玲，馬麗萍，郭曉夏，姜 娟，王魯雁，何湘君

(1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科；2. 北京大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100044； 3.衛(wèi)生部北京醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100730)

隨著近年來(lái)人們生活方式的改變，我國(guó)高血壓的發(fā)病率持續(xù)升高，其所導(dǎo)致的心腦血管疾病的危害日趨嚴(yán)重。既往研究發(fā)現(xiàn)，除血壓水平外，血壓晝夜節(jié)律異常也可導(dǎo)致心、腦、腎等靶器官損害，危害人類的生存與健康[1]。已有大量研究證實(shí)，血壓的晝夜節(jié)律變化與時(shí)鐘基因所產(chǎn)生的體內(nèi)生物鐘周期振蕩密切相關(guān)[2]。

正常生理情況下生物鐘通過(guò)時(shí)鐘基因的“轉(zhuǎn)錄-翻譯”反饋回路自主產(chǎn)生約24 h的節(jié)律性振蕩，整合時(shí)鐘輸入信號(hào)與外界環(huán)境保持同步化，控制下游鐘控基因的表達(dá)。目前，已發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物時(shí)鐘基因包括PER、CLOCK、BMAL1、CRY基因以及時(shí)鐘輸出基因DBP、HLF、TEF等[3]。哺乳動(dòng)物的生物鐘由中樞生物鐘和外周生物鐘構(gòu)成。中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核(SCN)，外周生物鐘存在于除SCN以外的多數(shù)組織，如心臟、血管、肝臟等，屬組織或細(xì)胞的內(nèi)在特性之一[4]。研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠的肥厚心肌和主動(dòng)脈組織中PER2蛋白表達(dá)高于正常大鼠，但晝夜時(shí)相相似[5]。體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞也證實(shí)，PER2、DBP、BMAL1可在72 h內(nèi)顯示晝夜節(jié)律，血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)短期刺激后，PER2基因的表達(dá)可顯著增強(qiáng)[6]。以上均提示，鐘基因PER2可能參與中樞生物鐘節(jié)律調(diào)控及外周生物鐘與中樞生物鐘同步化，影響血壓節(jié)律和導(dǎo)致靶器官損害。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)指在進(jìn)化過(guò)程中由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、高度保守的、同源mRNA高效特異降解的現(xiàn)象[7,9]。RNA干擾技術(shù)可特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，現(xiàn)已被廣泛用于探索基因功能、傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療等領(lǐng)域。慢病毒載體感染效率高, 是攜帶干擾RNA的理想載體[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在尋找合適的RNA干擾位點(diǎn)，構(gòu)建針對(duì)大鼠PER2基因的有效的RNAi慢病毒載體，為進(jìn)一步研究PER2基因與異常血壓節(jié)律及靶器官損害的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞系A(chǔ)7r5細(xì)胞購(gòu)自博慧斯生物(ATCC，CRL-1444)；含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基、100 mL/L胎牛血清、D-Hank’s溶液、Opti-MEM I無(wú)血清介質(zhì)、無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；0.5 g/L胰酶EDTA溶液購(gòu)自Hyclone公司；慢病毒-NC病毒液(1×108TU/mL)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；96孔板和6孔板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；dNTPs購(gòu)自Sangon公司；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)購(gòu)自Promega公司；RNA聚合酶抑制劑(40 U/μL)購(gòu)自TYOBO公司；TaqDNA多聚酶(5 U/μL)購(gòu)自TaKaRa公司；Polybrene、Real-time PCR Universal試劑盒(試劑盒號(hào)Cat號(hào)GMRS-001)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌A7r5細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱A7r5細(xì)胞)常規(guī)使用含100 mL/L胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時(shí)換液，傳代。

1.2.2大鼠PER2基因慢病毒shRNA干擾載體的構(gòu)建 以大鼠PER2基因(GenBank登錄號(hào)：AB 016532.1，GI：3845582)的cDNA序列為模板，遵循siRNA設(shè)計(jì)原則[9]，選擇RNAi靶序列，并進(jìn)行BLAST基因組同源性分析，確定4個(gè)作用干擾位點(diǎn)為本實(shí)驗(yàn)的PER2基因靶序列，確保選擇的siRNA序列與基因組中其他基因至少存在3個(gè)以上的堿基不同。由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成相應(yīng)的4組shRNA表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行慢病毒載體的包裝及測(cè)序鑒定。

1.2.3大鼠PER2基因慢病毒shRNA干擾載體轉(zhuǎn)染A7r5細(xì)胞 當(dāng)A7r5細(xì)胞在10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行胰酶消化后形成單細(xì)胞懸液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，按5×105細(xì)胞/孔的密度接種6孔板，混勻后37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)24 h。將慢病毒原液200 μL(慢病毒滴度檢測(cè)為1×108TU/mL)，用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液5倍稀釋，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及類型，加入終質(zhì)量濃度為5 μg/mL的Polybrene。吸去6孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入上述1 mL稀釋的病毒液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)24 h。吸棄6孔板中的稀釋病毒液，每孔加入1.5 mL含100 mL/L胎牛血清的DMEM培液，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，如有必要可分出1/3～1/5，于37 ℃、50 mL/L CO2繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h，通過(guò)熒光顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染熒光細(xì)胞評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4轉(zhuǎn)染不同慢病毒shRNA干擾載體后A7r5細(xì)胞PER2基因mRNA表達(dá)的檢測(cè) ①總RNA提?。簾晒廒呌诜€(wěn)定時(shí)采用Trizol方法提取細(xì)胞總RNA，所得RNA溶解于DEPC處理的ddH2O中，采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整度，采用分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度；②反轉(zhuǎn)錄為cDNA：在無(wú)菌EP管中配制如下體系，即2 μL的總RNA、1.2 μL的反轉(zhuǎn)錄酶、11.5 μL DEPC-H2O，70 ℃溫育混合物5 min，冰上驟冷。再加入4 μL 5×Reaction Buffer、0.8 μL 10 mmol/L dNTPs mix、0.5 μL(100 U)MMLV RTase RNaseH，在42 ℃溫育45 min，85 ℃加熱10 min終止反應(yīng)，冰上驟冷，反應(yīng)液用作PCR模板；③Real-time PCR：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PER2基因mRNA的表達(dá)水平。PER2上游引物5′-GAACTCCACAAACTTGGCATCACT-3′，下游引物5′-AGAACTCGGACATGTTTGCTGTG-3′，PCR擴(kuò)

增產(chǎn)物大小128 bp，由MX3000實(shí)時(shí)定量PCR儀完成(美國(guó)Stratagen公司生產(chǎn))?？偡磻?yīng)體積為20 μL，按照10 μL的2×Real-time PCR Master Mix、2 μL的cDNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.1 μL的0.1 μmol/L上、下游引物、0.4 μL的TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)、7.4 μL的滅菌去離子水。PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃ 3 min變性，1個(gè)循環(huán)，95 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以10 g/L瓊脂糖電泳，EB染色，用Bio-Rad公司的GS-700凝膠成像儀對(duì)電泳帶進(jìn)行紫外吸光度掃描，以PER2/GAPDH的相對(duì)灰度表示該基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1大鼠PER2基因慢病毒shRNA載體的鑒定根據(jù)RNAi的設(shè)計(jì)原則，以PER2基因的第417、859、1057、1 363位點(diǎn)為干擾點(diǎn)，將siRNA序列與慢病毒載體質(zhì)粒pGLV-U6-EGFP(圖1)連接，構(gòu)成4種PER2基因shRNA表達(dá)重組體pLentivirus-per2-rat-417、pLentivirus-per2-rat-859、pLentivirus-per2-rat-1057和pLentivirus-per2-rat-1363，依序標(biāo)記為C229、C230、C231和C232，基因測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入序列正確(表1)。

圖1慢病毒載體質(zhì)粒LV1-pGLV-U6-EGFP的結(jié)構(gòu)圖

Fig.1 cDNA structure of LV1-pGLV-U6-EGFP lentivector

表1針對(duì)大鼠PER2基因的4個(gè)siRNA靶點(diǎn)序列

Tab.1 Four target sequences of siRNA for rat PER2

標(biāo)號(hào)靶位點(diǎn)基因序列(5'～3')基因測(cè)序NCTTCTCCGAACGTGTCACGTC229per2-rat-417GCACACAAAGAGCTGATAAGGC230per2-rat-859GCAGTGGCTTAGATTCTTTCAC231per2-rat-1057GCTATGAAGCTCCTAGAATTCC232per2-rat-1363GCAGGAAGATATCCTTCATCA

2.2大鼠PER2基因慢病毒shRNA載體轉(zhuǎn)染效率的評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染不同濃度熒光標(biāo)記的pLenti-virus-per2-rat干擾載體72 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pLentivirus-per2-rat干擾載體后血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)與母系細(xì)胞(圖2A)相比呈圓形者增多，細(xì)胞排列較前稍顯紊亂(圖2B、2C)；各組細(xì)胞均可見熒光表達(dá)，高M(jìn)OI(multiplicity of infection)組表達(dá)綠色熒光細(xì)胞較多，但死亡細(xì)胞也不斷增加，故選擇MOI值約50的比例轉(zhuǎn)染，發(fā)綠熒光的細(xì)胞數(shù)約占70%，死亡的細(xì)胞較少(圖2B、2C)。由于該細(xì)胞系較難轉(zhuǎn)染，選擇進(jìn)行2次侵染的方式提高轉(zhuǎn)染效率。

2.3大鼠PER2基因慢病毒shRNA載體對(duì)A7r5細(xì)胞表達(dá)PER2基因mRNA的抑制作用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28S rRNA與18S rRNA的亮度比值約為2∶1，提示總RNA質(zhì)量較好，無(wú)降解(圖3)。圖4可見NTC僅有引物二聚體，顯示整個(gè)擴(kuò)增體系正常，無(wú)模板污染；各條帶單一，顯示擴(kuò)增產(chǎn)物特異性良好。對(duì)各組細(xì)胞的PER2基因與內(nèi)參基因GAPDH的Ct差值(ΔCt)、ΔCt與陰性對(duì)照的Ct差值(ΔΔCt)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果符合正態(tài)分布，選擇單因素方差分析對(duì)各組細(xì)胞PER2基因被抑制的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，各組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。進(jìn)一步行兩兩比較顯示，C231組和C232組顯著抑制大鼠PER2基因表達(dá)，兩組分別與陰性對(duì)照組、C229組和C230組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，抑制效率可達(dá)84%和91%，C231與C232兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

圖2自然光下正常A7r5細(xì)胞(A)及侵染72h后的轉(zhuǎn)染效率(B、C)

Fig.2 Normal A7r5 VSMCs in natural light (A) and the efficiency of pLentivirus-per2-rat transfection after 72 h (B, C)

B：亮視野；C：暗視野。

圖3總RNA的電泳圖

Fig.3 Electrophoretogram of total RNA extraction

圖4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

Fig.4 Electrophoretogram of PCR amplification products

表2大鼠PER2基因慢病毒shRNA載體對(duì)A7r5細(xì)胞PER2基因mRNA表達(dá)的抑制作用

Ct空白(n=3)NC(n=3)C229(n=3)C230(n=3)C231(n=3)C232(n=3)PER2 Mean Ct17.07±0.2520.83±0.2520.02±0.2620.98±0.1823.28±0.2520.59±0.16GAPDH Mean Ct17.12±0.0720.50±0.0819.30±0.0619.68±0.1120.64±0.1217.19±0.15ΔCt-0.05±0.260.33±0.260.72±0.271.30±0.182.64±0.283.40±0.32ΔΔCt0.00±0.370.38±0.370.77±0.371.35±0.322.69±0.38▲3.45±0.34*2-ΔΔCt1.00(0.77～1.29)0.77(0.6～0.99)0.59(0.45～0.76)0.39(0.31～0.49)0.16(0.12～0.20)0.09(0.07～0.12)

Mean Ct是3個(gè)重復(fù)孔Ct 值的平均值，該項(xiàng)“±”后的數(shù)值為3次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。ΔCt指同一樣品中，待檢基因與內(nèi)參基因平均Ct值的差值。ΔΔCt指其余樣品的ΔCt值和對(duì)照樣品相應(yīng)基因的ΔCt值之差。2-ΔΔCt是按照ΔΔCt所計(jì)算，后面置信區(qū)間也是根據(jù)ΔΔCt的范圍所計(jì)算。單因素方差分析顯示，C231與陰性對(duì)照(NC)及C229、C230比較，▲P<0.05；C232與陰性對(duì)照(NC)及C229、C230比較，*P<0.05。

3 討 論

PER2基因是時(shí)鐘基因的重要組分之一，其與PER1、PER3、CRY1、CRY2等共同組成調(diào)節(jié)蛋白的負(fù)向分支，和轉(zhuǎn)錄因子的正向分支(BMAL1、CLOCK和NPAS2)通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯和后翻譯等過(guò)程，形成一系列相互作用自發(fā)調(diào)節(jié)的負(fù)反饋環(huán)路，產(chǎn)生24 h周期振蕩，形成了晝夜節(jié)律(circadian rhythm)[3]。哺乳動(dòng)物包括人類和小鼠的心血管系統(tǒng)同樣存在時(shí)鐘基因的節(jié)律性表達(dá)[10-12]。研究證實(shí)，動(dòng)物體內(nèi)的PER2基因常在夜間高表達(dá)，而BMAL1常在白晝表達(dá)增加，PER基因作用于BMAL1的E-box，刺激BMAL1基因的表達(dá)。已證實(shí)BMAL1靶基因敲除小鼠也出現(xiàn)血壓晝夜節(jié)律的消失[13]。持續(xù)黑暗狀態(tài)下，CRY1/CRY2缺陷小鼠(雙基因敲除/DKO)與野生型小鼠(WT)比較白天為高血壓(嚙齒類此時(shí)間血壓下降)[14]。故推測(cè)若抑制PER2，有可能CLOCK/ BMAL1異源二聚體形成將減少，可能導(dǎo)致時(shí)鐘基因 PER、BMAL1和輸出基因包括Dbp等蛋白翻譯下降，影響神經(jīng)體液的晝夜分泌，影響血壓晝夜節(jié)律，參與高血壓的發(fā)生發(fā)展。

動(dòng)脈粥樣硬化是高血壓患者常見的靶器官損害，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖是動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)。研究表明，Ang Ⅱ可誘導(dǎo)培養(yǎng)的乳大鼠心肌細(xì)胞核內(nèi)時(shí)鐘基因PER2、BMAL1、DBP表達(dá)增強(qiáng)[15]，提示心臟局部的RAS在促進(jìn)心肌肥厚的過(guò)程中與時(shí)鐘體系的基因表達(dá)變化之間有某種聯(lián)系，而作為參與高血壓發(fā)病機(jī)制的重要成分，VSMCs在調(diào)節(jié)血壓節(jié)律及細(xì)胞增殖方面的作用尚未明確。本實(shí)驗(yàn)選取血管平滑肌細(xì)胞作為RNA干擾抑制的靶細(xì)胞，將為我們探索時(shí)鐘基因組分在血壓節(jié)律調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖方面的作用提供一種途徑。

RNA干擾技術(shù)已廣泛用于基因研究及應(yīng)用，該技術(shù)簡(jiǎn)單快速、高效經(jīng)濟(jì)、效果特異，可進(jìn)行基因功能分析[16]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究[17]、新藥開發(fā)[18]及基因治療等多個(gè)領(lǐng)域[19-21]。合成siRNA的方法有兩大類：體外合成和體內(nèi)轉(zhuǎn)錄。體外合成包括化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄及酶消化法，其中化學(xué)合成法為應(yīng)用已找到最有效的siRNA序列進(jìn)行單核苷酸直接化學(xué)合成，簡(jiǎn)便、有效、產(chǎn)物純度高，但合成周期長(zhǎng)、作用時(shí)間短、轉(zhuǎn)染效率差別大而且價(jià)格高。體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的原理是利用攜帶siRNA的質(zhì)粒、病毒表達(dá)載體或帶有siRNA表達(dá)盒的PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)染入目的細(xì)胞并整合至宿主細(xì)胞基因組而表達(dá)產(chǎn)生靶基因的siRNA起到RNA干擾作用。表達(dá)載體常用能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)shRNA的含有RNA聚合酶Ⅲ(pol Ⅲ) 啟動(dòng)子的載體[22]。該方法可提高對(duì)原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化細(xì)胞等較難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，插入較大的片段(-7.5 kb)并將免疫反應(yīng)降到最低，使得目的基因整合至宿主細(xì)胞基因組的幾率明顯增加，可獲得目的基因siRNA的高水平的表達(dá)，提高沉默基因效力。本實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中曾選用siRNA化學(xué)合成法及shRNA體外轉(zhuǎn)錄方法，效果均欠佳，分析原因主要為細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低，即使提高siRNA或shRNA的濃度及選擇不同細(xì)胞濃度和脂質(zhì)體2000的比例，轉(zhuǎn)染效率也維持在30%～50%左右，遠(yuǎn)不能達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需要求。這與siRNA或shRNA本身的轉(zhuǎn)染率相對(duì)較低及A7r5細(xì)胞系本身難于被轉(zhuǎn)染有關(guān)。結(jié)果證實(shí)，調(diào)整siRNA的制備方式，以慢病毒為載體將shRNA導(dǎo)入慢病毒pGLV-U6-EGFP質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染細(xì)胞改善轉(zhuǎn)染效果，使血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)靶基因Per2的siRNA從而達(dá)到沉默PER2基因成為可能。

由于本實(shí)驗(yàn)初期時(shí)siRNA及shRNA轉(zhuǎn)染效率低及濃度過(guò)大可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故在選擇病毒載體時(shí)充分考慮其感染效率、對(duì)細(xì)胞活力的影響及安全性等因素。而慢病毒載體系統(tǒng)為VSV-G膜蛋白包裹，可增加病毒感染譜；其LTR的轉(zhuǎn)錄激活能力低于逆轉(zhuǎn)錄病毒，激活原癌基因能力也相對(duì)較低；重組慢病毒顆粒以同時(shí)采用“自我滅活”修飾，阻止子代病毒自我復(fù)制和轉(zhuǎn)移，從而保證產(chǎn)生的慢病毒具備最低的細(xì)胞毒性和良好的生物安全性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，通過(guò)更換導(dǎo)入方式、2次侵染及調(diào)整合適的感染復(fù)數(shù)(MOI值)等方法，慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率較siRNA和shRNA明顯增加，未出現(xiàn)明顯靶細(xì)胞A7r5死亡。

本實(shí)驗(yàn)共構(gòu)建4組siRNA干擾序列，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后A7r5細(xì)胞PER2基因的mRNA表達(dá)，初步證實(shí)C231組(pLentivirus-per2-rat-1057)和C232組(pLentivirus-per2-rat-1363)干擾序列可有效沉默大鼠PER2基因的表達(dá)，可進(jìn)一步通過(guò)了解PER2基因在蛋白水平的表達(dá)變化證實(shí)其沉默效果。其他序列不能有效沉默基因表達(dá)，可能與選擇的干擾序列位點(diǎn)是否符合siRNA的設(shè)計(jì)原則、所選序列作用位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和堿基配對(duì)程度及細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的活力有關(guān)。

本研究針對(duì)大鼠PER2基因設(shè)計(jì)選擇不同的siRNA序列，連接到LV1-pGLV-U6-EGFP質(zhì)粒中構(gòu)建大鼠PER2基因shRNA慢病毒載體，通過(guò)檢測(cè)慢病毒載體轉(zhuǎn)染的大鼠血管平滑肌A7r5細(xì)胞的PER2基因mRNA表達(dá)情況，篩選出有效干擾PER2基因表達(dá)的siRNA序列，為進(jìn)一步研究時(shí)鐘基因各組分的表達(dá)、調(diào)控等基因功能，及其在血壓晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、異常血壓節(jié)律形成和靶器官損害等疾病發(fā)生機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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