徐 濤，張金莉，曾 妍，王 攀，郎慧芳，萬傳君，顧永清

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所放射毒理與輻射危害評價研究室，北京 100850； 2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室，新疆石河子 832000；3. 南通大學(xué)附屬醫(yī)學(xué)院消化科 實驗室，江蘇南通 226000；4. 駐馬店衛(wèi)生學(xué)校微生物免疫教研室，河南駐馬店 463000)

人類CHD4/Mi-2β蛋白屬于ATP酶超家族，該蛋白質(zhì)因氨基端開始依次含有染色質(zhì)調(diào)節(jié)域(ATP-dependent chromatin-remodeling complexes)、類SWI2/SNF2 ATP酶/解螺旋酶域和DNA結(jié)合域而得名[1]。CHD4/Mi-2β與反式激活蛋白及抑制蛋白均能相互作用，并直接與染色質(zhì)重構(gòu)蛋白相關(guān)，為參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的多蛋白超復(fù)合物的形成提供新的視野[2]。CHD4/Mi-2β蛋白參與DNA的損傷反應(yīng)，并且與DNA損傷標(biāo)記蛋白γ-H2AX有共定位現(xiàn)象。沉默 CHD4/Mi-2β基因，細(xì)胞自發(fā)性DNA損傷增多和輻射敏感性增強。CHD4/Mi-2β是ATM激酶的底物，其S1349位點可被ATM磷酸化，CHD4/Mi-2β-pS1349蛋白與染色質(zhì)結(jié)合更為緊密，為DNA損失修復(fù)提供時間上的保障[1,3-4]。CHD4/Mi-2β、HDAC1、MTA2是目前已知的染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合物NuRD的成員，其中HDAC1、MTA2已經(jīng)被證實具有調(diào)節(jié)p53的功能，p53蛋白參與G1/S的調(diào)控和細(xì)胞凋亡[5-6]。CHD4/Mi-2β如何參與DNA的損傷修復(fù)過程尚未明確。為深入研究CHD4/Mi-2β的功能，本研究采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了CHD4/Mi-2β基因的結(jié)構(gòu)域原核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究CHD4/Mi-2β的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料CHD4-HA真核表達(dá)質(zhì)粒含CHD4/Mi-2β基因編碼區(qū)全長，由劍橋大學(xué)Steve Jackson博士惠贈。pGEX-5T質(zhì)粒本實驗室保持；KOD DNA聚合酶購自TOYOBO公司；DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、PCR純化試劑盒購自北京天根生化科技公司；限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶購自Bio Labs公司；GST親和樹脂購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司；IPTG購自Promega公司；抗GST一抗購自Santa Cruz Biotechnology；抗山羊抗小鼠IgG辣根酶標(biāo)記購自中杉公司；ELC購自Cell Signaling Biotechnology；引物合成與重組質(zhì)粒的測序由北京華大基因完成。

1.2目的基因的獲得及重組表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)CHD4/Mi-2β蛋白的結(jié)構(gòu)域，設(shè)計3對引物，分別擴(kuò)增含染色質(zhì)的調(diào)節(jié)區(qū)、解旋酶區(qū)和DNA結(jié)合區(qū)，引物序列及PCR擴(kuò)增條件見表1。在上游引物引入XmaⅠ酶切位點，下游引物引入KpnⅠ位點。PCR反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)參數(shù)見表1。限制性內(nèi)切酶雙酶切PCR產(chǎn)物及pGEX-5T原核表達(dá)載體，割膠回收純化后，將目的片段與線性化pGEX-5T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGST-CHD4-C、pGST-CHD4-D及pGST-CHD4-H，并由北京華大基因測序中心對其進(jìn)行測序鑒定。

1.3蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)測序鑒定正確的pGST-CHD4-C、pGST-CHD4-D及pGST-CHD4-H質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，挑取單克隆37 ℃培養(yǎng)，待細(xì)菌生長至對數(shù)生長期(A600=0.6～0.8)時，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h后4 ℃離心收集細(xì)菌。按照100 mL菌液加入4 mL冰預(yù)冷的PBST重懸細(xì)菌，冰上超聲裂解菌液5 min，4 ℃ 12 000×g離心15 min，分別取上清進(jìn)行SDS-PAGE后行考馬斯亮藍(lán)染色，分析目的蛋白的表達(dá)。

表1CHD4/Mi-2β截短體引物序列及擴(kuò)增條件

Tab.1 Primer sequences and amplification conditions of recombinant plasmid of CHD4/Mi-2β

名 稱引物序列PCR擴(kuò)增條件CHD4-CUp:5>cgccccgggtstggcgtcgggcctgggctcc<3Dw:5 >cgcggtacctcaaggcctctccaacttccgaag <395℃ 5min;(94℃ 30s, 57℃ 30s,72℃ 150s)×35 cycles; 72℃ 7min。 片段2100bpCHD4-DUp:5 > cgccccgggtgacacagaattgcagggcatg<3Dw:5 > cgcggtacctcactgctgctgggctacctg<395℃ 5min;(94℃ 30s, 57℃ 30s,72℃ 120s)×35 cycles; 72℃ 7min。 擴(kuò)增1938bpCHD4-HUp:5 > cgccccgggtccagaaacgccaacagttgat<3Dw:5>cgcggtacctcattcccgtaccacatactgggc<395℃ 5min;(94℃ 30s, 57℃ 30s,72℃ 120s)×35 cycles; 72℃ 7min。 擴(kuò)增1767bp

1.4蛋白的洗滌及純化取250 mL誘導(dǎo)菌液上清用0.45 μm濾膜過濾，與5 mL谷胱甘肽瓊脂糖樹脂勻漿混合，4 ℃旋轉(zhuǎn)混懸儀上孵育4～5 h。4 ℃ 500×g離心5 min，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別加入10倍柱床體積的冰冷PBST洗滌，重復(fù)洗滌3次。去掉上清，在谷胱甘肽瓊脂糖樹脂中加入1倍柱床體積的冰冷谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫，室溫輕輕攪動10 min，4 ℃ 500×g離心5 min，上清移至新EP管，重復(fù)洗脫3次。收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5Westernblot檢測純化產(chǎn)物進(jìn)行Western blot檢測，按照GST抗體說明書要求進(jìn)行，檢測重組蛋白純化產(chǎn)物的特異性。純化產(chǎn)物行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入抗GST抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次，10 min/次，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，10 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

2 結(jié) 果

2.1截短體的構(gòu)建及序列的鑒定以CHD4-HA質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出CHD4-C、CHD4-D、CHD4-H基因片段，PCR片段大小均在2 000 bp左右，符合預(yù)期擴(kuò)增大小(圖1)。PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)載體pGEX-5T雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化，挑取單克隆行PCR菌落陽性鑒定。由圖2A可見，各個目的載體均有陽性克隆插入，陽性率約為50%。單克隆陽性菌搖菌并送測序，提取質(zhì)粒用XmaⅠ/KpnⅠ雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳后分別在約2 000 bp處有一DNA條帶，符合預(yù)期結(jié)果(圖2B)。陽性克隆質(zhì)粒測序結(jié)果比對，與GenBank序列完全一致。

圖1CHD4-C、CHD4-D、CHD4-H的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

Fig.1 Results of electrophoresis of PCR products of CHD4-D, CHD4-C and CHD4-H

1：CHD4-D；2：CHD4-C；3：CHD4-H。

2.2截短體蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化將經(jīng)測序鑒定正確的pGST-CHD4-C、pGST-CHD4-D及pGST-CHD4-H質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞，SDS-PAGE分析細(xì)胞裂解上清，顯示融合蛋白上清液中的表達(dá)量較高。各融合蛋白GST-CHD4-C、GST-CHD4-D及GST-CHD4-H分子質(zhì)量分別符合預(yù)期值，表明蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功(圖3A)。采用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析純化融合蛋白，收集洗脫液，行SDS-PAGE分析，可見蛋白純化蛋白位置正確，無明顯雜帶，純度達(dá)95%以上(圖3B)。

圖2陽性克隆篩選的瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.2 Positive clones were identified by agarose gel electrophoresis

A：PCR陽性克隆篩選的瓊脂糖凝膠電泳圖。M：DNA ladder(100～5 000 bp)；1～4：CHD4-C菌落克隆；5～8：CHD4-D菌落克?。?～13：CHD4-H菌落克?。籶：陽性對照；n：陰性對照。B：雙酶切陽性克隆篩選的瓊脂糖凝膠電泳圖。M：DNA ladder(100～5 000 bp)；1：pGEX-5T質(zhì)粒；2、3、4、5：pGEX-5T、pGST-CHD4-C、pGST-CHD4-D和pGST-CHD4-H重組質(zhì)粒由XmaⅠ/KpnⅠ雙酶切。

圖3CHD4/Mi-2β截短體融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化的SDS-PAGE分析

Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant plasmid CHD4/Mi-2β fusion protein by induced expression and purification

A：融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析。M：Marker(25～130 ku)；1、3、5、7：GST-CHD4-C、GST-CHD4-D、GST-CHD4-H和GST蛋白未加誘導(dǎo)劑對照；2、4、6、8：GST-CHD4-C、GST-CHD4-D、GST-CHD4-H和GST蛋白誘導(dǎo)后上清；箭頭示目的融合蛋白。B：融合蛋白純化后的SDS-PAGE分析。M：Marker(16～250 ku)；1、3、5：GST-CHD4-C、GST-CHD4-D、GST-CHD4-H蛋白未加誘導(dǎo)劑對照；2、4、6：GST-CHD4-C、GST-CHD4-C、GST-CHD4-D純化后蛋白。

2.3融合蛋白的Westernblot鑒定取1 μg純化的GST融合蛋白行SDS-PAGE及Western blot進(jìn)一步鑒定各截短體融合蛋白。結(jié)果顯示，各蛋白均與抗GST抗體結(jié)合(圖4)，GST-CHD4-C、GST-CHD4-D及GST-CHD4-H蛋白位置符合預(yù)期大小，表明原核表達(dá)及純化成功。

圖4CHD4/Mi-2β截短體融合蛋白的Westernblot分析

Fig.4 Western blot analysis of CHD4/Mi-2β truncated fusion protein

1、2、3：GST-CHD4-C、GST-CHD4-D 和GST-CHD4-H蛋白。

3 討 論

CHD4/Mi-2蛋白最初是從人類皮肌炎患者中鑒定出來的自身抗原，屬于高度保守的CHD蛋白家族[7]。CHD4/Mi-2β與HDAC1、HDAC2、MTA2、MBD2和MBD3等蛋白構(gòu)成NuRD復(fù)合物，該復(fù)合物具備核小體重構(gòu)活性和組蛋白去乙?；富钚訹8-9]。CHD4/Mi-2β的鋅子鍵結(jié)構(gòu)通過對組蛋白H3 Lys9的乙?；蚪M蛋白H3的甲基化從而綁定到組蛋白H3的尾端，同一個鋅子鍵結(jié)構(gòu)域綁定不同的組蛋白標(biāo)記，會產(chǎn)生相反的過程，比如基因的激活和抑制[10]。DNA修復(fù)和細(xì)胞周期監(jiān)測點是維持基因組穩(wěn)定性的兩個關(guān)鍵分子機(jī)制，此功能的缺陷將顯著增加細(xì)胞發(fā)生癌變的傾向性。POLE等研究發(fā)現(xiàn)，CHD4/Mi-2β本身雖然并不具有乙酰轉(zhuǎn)移酶或脫乙酰酶功能，無法直接參與對p53乙酰化來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，然而在NuRD復(fù)合物中，MTA2具有調(diào)節(jié)p53乙?；δ?。CHD4/Mi-2β的缺失不影響HDAC1、MTA2的表達(dá)水平，支持CHD4通過促進(jìn)HDAC1對p53去乙酰化，參與細(xì)胞G1/S周期過渡的調(diào)節(jié)[11]。

CHD4/Mi-2β基因缺失后真核細(xì)胞穩(wěn)定性下降，其機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。為研究CHD4/Mi-2β各結(jié)構(gòu)域在真核細(xì)胞中的功能與作用機(jī)制，本研究構(gòu)建了GST-CHD4-C、GST-CHD4-D及GST-CHD4-H 3個重組質(zhì)粒。對pGEX-5T原核表達(dá)載體的選取具有以下幾個優(yōu)點：①PGEX-5T載體質(zhì)粒構(gòu)建中SD、RBS序列不需要考慮。其載體的SD及RBS序列，不會因為外源基因插入形式的不同而改變，是因為pGEX-5T載體的多克隆位點在GST基因之后，GST融合蛋白就可以表達(dá)出。②載體中具有可誘導(dǎo)的強啟動子tac啟動子。因為載體本身帶有l(wèi)ac基因，在大腸桿菌lac Ⅰ菌株中，它的轉(zhuǎn)錄需經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的性質(zhì)也不會改變。在表達(dá)外源蛋白的過程中，根據(jù)需

表達(dá)的外源蛋白的性質(zhì)，進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)，可以得到最高的產(chǎn)率。③蛋白純化條件溫和，有利于GST融合蛋白保持其蛋白活性。直接從細(xì)菌裂解液中用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析吸附，洗脫條件溫和，整個過程無變性劑的加入。④GST與目的蛋白洗脫液分離簡便。因此，pGEX-5T載體更方便地與目的基因重組和篩選，更能有效地在原核細(xì)胞中表達(dá)。本研究成功構(gòu)建了CHD4-C、CHD4-D、CHD4-H截短體，為CHD4的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

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