王榮榮 劉 曉 陸 蘇 顧 林 向 榮 劉 紅

·臨床研究與應(yīng)用·

乳腺癌中BAG-1 EGFR和PARP-1的表達(dá)及其臨床意義

王榮榮①劉 曉①陸 蘇①顧 林①向 榮②劉 紅①

目的：觀察乳腺癌組織芯片中BAG-1、EGFR和PARP-1的表達(dá)及其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，并探討其臨床意義。方法：采用免疫組織化學(xué)法對159例組織芯片中乳腺癌和癌旁組織點(diǎn)行BAG-l、EGFR及PARP-1蛋白檢測，同時分析其與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果：乳腺癌組織中BAG-1、EGFR、PARP-1蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P＜0.05）。BAG-1蛋白表達(dá)水平與年齡、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、臨床分期均無明顯相關(guān)性，但與腫瘤大小、組織學(xué)分級、ER、PR和HER-2表達(dá)以及分子分型有關(guān)（P＜0.05）；EGFR蛋白表達(dá)水平與腫瘤大小、臨床分期以及分子分型有明顯相關(guān)性（P＜0.05）；PARP-1與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、ER表達(dá)以及分子分型有關(guān)（P＜0.05）。119例病例中BAG-1蛋白表達(dá)與EGFR、PARP-1蛋白表達(dá)無明顯相關(guān)性，但在三陰性乳腺癌（TNBC）中BAG-1蛋白表達(dá)與PARP-1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。單因素分析結(jié)果顯示，BAG-1、PARP-1蛋白表達(dá)和分子分型是影響乳腺癌患者預(yù)后的因素。多因素分析結(jié)果顯示，BAG-1、PARP-1蛋白表達(dá)是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。結(jié)論：乳腺癌中BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白高表達(dá)提示其可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，BAG-1、EGFR和PARP-1高表達(dá)可作為乳腺癌診治和預(yù)后的生物指標(biāo)。

乳腺癌 免疫組織化學(xué) BAG-1 表皮生長因子受體 聚ADP核糖聚合酶-1

1Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Can

cer Prevention and Therapy,Tianjin,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therapy,Tianjin Medical University,Min

istry of Education,Tianjin 300060;2Nankai University Medical School,Tianjin 300071,China.

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康最常見的惡性腫瘤之一。近年來隨著對乳腺癌基礎(chǔ)與臨床研究的不斷深入，乳腺癌發(fā)病機(jī)制及治療的研究取得重大進(jìn)展［1］，但影響乳腺癌治療及預(yù)后的相關(guān)因素及這些因素的關(guān)系仍不明確，尤其是三陰性乳腺癌（TNBC）。TNBC作為一種惡性程度高，預(yù)后較差的一類特殊乳腺癌，目前尚無針對其有效的藥物，缺乏藥物有效靶點(diǎn)［2］。研究表明Bcl-2結(jié)合抗凋亡基因-1（Bcl-2 associated athanogene-1，BAG-1）是一種可與多個靶點(diǎn)相互作用的多功能蛋白，在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)［3］。表皮生長因子受體（EGFR）屬于受體酪氨酸激酶家族之一，其過度表達(dá)可能與腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，聚ADP核糖聚合酶-l（poly ADP-ribose polymerase-l，PARP-1）表達(dá)上調(diào)可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)。但乳腺癌中BAG-1表達(dá)與EGFR和PARP-1表達(dá)關(guān)系及臨床意義尚不清楚。本研究采用免疫組織化學(xué)法對乳腺癌組織中BAG-1、EGFR和PARP-1進(jìn)行檢測，并結(jié)合臨床病理資料探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 乳腺癌組織芯片購自上海芯超生物科技有限公司。每張芯片含159例乳腺組織點(diǎn)，包括119例乳腺癌組織和40例癌旁組織（個別組織點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)過程中脫片）?；颊呔鶠榕裕形荒挲g為50（29～83）歲，病理類型均為浸潤性導(dǎo)管癌，隨訪中位時間為110（2～131）個月。本研究經(jīng)本院倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑 兔抗人BAG-1抗體購自美國Abcam公司，兔抗人EGFR、PARP-1抗體購自美國CST公司。工作濃度均為1：100。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 采用免疫組織化學(xué)法檢測BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白表達(dá)。主要步驟如下：組織芯片常規(guī)脫蠟至水后微波修復(fù)抗原，3%過氧化氫洗脫10 min，5%正常山羊血清室溫封閉組織1 h。分別滴加兔抗人BAG-1、EGFR和PARP-1單克隆抗體，5%正常山羊血清稀釋（1∶100）抗體，4℃冰箱過夜。滴加生物素標(biāo)記的二抗，5%正常山羊血清稀釋（1∶200）抗體，室溫孵育組織2 h，HRP-生物素偶聯(lián)的三抗室溫孵育1 h。上述各步驟結(jié)束后均以PBS震蕩洗滌3次、各5 min，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染、脫水透明、中性樹膠封固。陰性對照為PBS替代一抗和正常兔血清替代一抗的空白對照，以已知陽性的乳腺癌標(biāo)本為陽性對照。

1.2.2 結(jié)果判定 由兩位具備高級職稱的乳腺病理學(xué)專家進(jìn)行雙盲閱片，一致率達(dá)95%以上。根據(jù)染色強(qiáng)度和染色面積對組織點(diǎn)染色進(jìn)行分級。染色強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分，共4個級別；染色面積判定標(biāo)準(zhǔn)：每個組織點(diǎn)光鏡（×400）下隨機(jī)觀察5個視野，每個視野觀察100個細(xì)胞，計數(shù)陽性細(xì)胞百分比。BAG-1陽性細(xì)胞＜1%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，＞80%為4分；EGFR陽性細(xì)胞＜1%為0分，1%～10%為1分，11%～30%為2分，＞30%為3分；PARP-1陽性細(xì)胞＜1%為0分，1%～5%為1分，6%～25%為2分，26%～50%為3分，＞50%為4分。染色強(qiáng)度和染色面積兩者計分相乘即染色等級：分為陰性、弱陽性、中陽性和強(qiáng)陽性4個等級。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。陽性表達(dá)率比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存率的比較，采用Cox回歸分析進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白的表達(dá)

BAG-1蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒（圖1A）；EGFR蛋白陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞膜，呈線樣結(jié)構(gòu)，部分陽性細(xì)胞著色位于細(xì)胞質(zhì)（圖1B）；PARP-1蛋白陽性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞核，也可見于細(xì)胞質(zhì)（圖1C）。119例乳腺癌組織中BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白的表達(dá)率分別為95.80%（114/119）、31.09%（37/119）和57.14%（68/ 119），均明顯高于40例癌旁組織（個別組織點(diǎn)脫片）的表達(dá)率73.53%（25/34）、13.51%（5/37）和22.86%（8/ 35）（均P＜0.05）。

?A.BAG-1 expression；B.EGFR expression；C.PARP-1 expression圖1 乳腺癌中組織BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白的陽性表達(dá)（SP×400）Figure 1 BAG-1，EGFR，and PARP-1 expression in breast cancer（SP×400）

2.2 BAG-1、EGFR和PARP-1蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

BAG-1蛋白的陽性表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、臨床分期無顯著相關(guān)性（P＞0.05），與腫瘤大小、組織學(xué)分級、ER、PR、HER-2表達(dá)以及分子分型相關(guān)（P＜0.05），腫瘤體積較大、組織學(xué)分級差、ER、PR陽性以及HER-2陰性的患者BAG-1陽性表達(dá)率較高；EGFR蛋白表達(dá)水平與腫瘤大小、臨床分期以及分子分型具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）；PARP-1與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、ER表達(dá)以及分子分型相關(guān)（P＜0.05），見表1。EGFR和PARP-1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)顯著高于其他分子亞型中的表達(dá)（P＜0.05）。在三陰性乳腺癌中對BAG-1與EGFR和PARP-1的陽性表達(dá)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示BAG-1陽性表達(dá)與EGFR陽性表達(dá)無顯著相關(guān)性，而與PARP-1陽性表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。

2.3 影響乳腺癌預(yù)后的單因素分析

單因素Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，BAG-1、PARP-1表達(dá)以及分子分型是影響乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)因素（表2），BAG-1高表達(dá)（圖2A）、PARP-1陽性表達(dá)（圖2B）以及三陰性乳腺癌亞型（圖3）的患者預(yù)后均較差。

2.4 影響乳腺癌患者預(yù)后的多因素分析

將單因素分析中影響乳腺癌患者預(yù)后的BAG-1、PARP-1表達(dá)狀態(tài)以及分子分型引入Cox回歸模型進(jìn)行分析，結(jié)果表明BAG-1、PARP-1表達(dá)狀態(tài)是影響乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素（表3）。

表1 BAG-1、EGFR和PARP-1表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 例（%）Table 1 Relationship of BAG-1，EGFR，and PARP-1 expression with clinico pathologic indicators n（%）

表2 影響乳腺癌患者預(yù)后的單因素分析Table 2 Correlation of various indicators with overall survival（OS）in breast cancer

圖2 BAG-1、PARP-1不同表達(dá)組乳腺癌患者的OS生存曲線Figure 2 Kaplan-Meier curves for the OS of breast cancer according to BAG-1 and PARP-1 expressions

圖3 三陰性或非三陰性乳腺癌患者的OS生存曲線Figure 3 Kaplan-Meier curves for the OS of breast cancer according to TNBC or non-TNBC

表3 影響乳腺癌患者預(yù)后的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of prognostic factors in breast cancer

3 討論

近年來，乳腺癌的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢。在我國大部分地區(qū)，乳腺癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中已經(jīng)躍居首位［4］，因此開展乳腺癌防治研究以控制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展極為重要。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展涉及到多種癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引起的細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，但是目前乳腺癌的發(fā)病機(jī)制仍不明確。因此進(jìn)一步研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制并尋求早期診斷及防治措施成為焦點(diǎn)。BAG-1、EGFR和PARP-1三者在乳腺癌中的研究均有報道，三者對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用，但三者共同在乳腺癌中的研究鮮見報道，因此探討三者在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，將會對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及防治產(chǎn)生重大意義。

BAG-1是Cutress等［5］在尋找抗凋亡Bcl-2蛋白和活化的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合蛋白的相關(guān)研究時發(fā)現(xiàn)的另一種抗凋亡基因，其可以通過與大量的細(xì)胞靶點(diǎn)相互作用來實(shí)現(xiàn)其多功能的抗凋亡作用，而且通過作用于分子伴侶等多種蛋白分子調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)錄、遷移和運(yùn)動［6-7］。研究表明，BAG-1在乳腺癌中的陽性表達(dá)率較高，并且其表達(dá)與臨床分期、組織學(xué)分級及預(yù)后密切相關(guān)［8-9］。但另有研究顯示，BAG-1表達(dá)與組織學(xué)分級無相關(guān)性［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，BAG-1在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，并且腫瘤體積越大分化水平越低，BAG-1的表達(dá)水平越高預(yù)后越差，這與文獻(xiàn)［8-9］報道類似。另外，本研究發(fā)現(xiàn)ER、PR陽性以及HER-2陰性的患者，BAG-1陽性表達(dá)率較高。因此推測BAG-1的表達(dá)可評價乳腺癌患者的預(yù)后，并且與內(nèi)分泌及靶向藥物治療的耐藥相關(guān)。

眾所周知，EGFR在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。研究表明［11-12］，EGFR在多種人類腫瘤中過表達(dá)，其過表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)，在乳腺癌中EGFR和HER-2常共同表達(dá)（10%～36%），與預(yù)后不良相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，其陽性表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期相關(guān)，并且EGFR蛋白在TNBC中的陽性表達(dá)率顯著高于其他分子亞型，這與Rakha等［12］研究一致，說明EGFR可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，且可以作為TNBC的一個預(yù)后指標(biāo)。

PARP-1是一類存在于多數(shù)真核細(xì)胞中具有重要生理功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶，在DNA損傷修復(fù)、DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖分化調(diào)控、細(xì)胞凋亡及基因組的穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)PARP-1在乳腺癌中表達(dá)顯著高于癌旁組織，且乳腺癌組織分化程度越差淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多，ER陽性表達(dá)患者其表達(dá)率越高，并且在TNBC中的表達(dá)高于非TNBC，推測PARP-1表達(dá)上調(diào)可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后相關(guān)，并且可能成為TNBC的治療靶點(diǎn)，這與文獻(xiàn)［13-14］研究一致。

既往研究表明［15］，BAG-1作為細(xì)胞內(nèi)分子伴侶，可以和多種生長因子受體結(jié)合，降低BAG-1表達(dá)以提高EGFR表達(dá)。推測BAG-1可能與EGFR結(jié)合，通過改變EGFR蛋白表達(dá)及穩(wěn)定性影響其功能。本研究結(jié)果顯示，BAG-1蛋白與EGFR蛋白表達(dá)無顯著相關(guān)性，因此二者之間的相關(guān)性需進(jìn)一步研究證實(shí)。BAG-1和PARP-1均為細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵分子，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，在TNBC患者中BAG-1陽性表達(dá)與PARP-1陽性表達(dá)呈正相關(guān)，提示在TNBC中BAG-1與PARP-1共同參與其發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后。另外，EGFR和PARP-1在TNBC中的表達(dá)均高于非TNBC，二者可能作為TNBC的治療靶點(diǎn)，從而提高患者的生存期和生活質(zhì)量。

總之，BAG-1、EGFR和PARP-1高表達(dá)狀態(tài)可能與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有關(guān)，可能成為乳腺癌診治及預(yù)后的生存指標(biāo)。并且三者在TNBC中扮演著重要的角色，對于進(jìn)一步尋找TNBC治療有效靶點(diǎn)，提高TNBC患者的生存期和生活質(zhì)量有重要意義。但是由于乳腺癌預(yù)后受多種因素影響，如手術(shù)方式、術(shù)后治療等，這些因素在本研究中不易控制。因此關(guān)于影響乳腺癌預(yù)后的因素需要進(jìn)一步行前瞻性的研究，BAG-1、EGFR和PARP-1三者在乳腺癌中的作用機(jī)制仍需更加深入的研究。

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（2014-01-15收稿）

（2014-05-11修回）

（本文編輯：張亻 刡）

BAG-1,EGFR,and PARP-1 expressions in breast cancer and their clinical significance

Rongrong WANG1,Xiao LIU1,Su LU1,Lin GU1,Rong XIANG2,Hong LIU1
Correspondence to:Hong LIU;E-mail:lh713@163.com

Objective:To observe BAG-1,EGFR,and PARP-1 expressions in invasive breast cancer and its correlation with clinical pathological indicators,as well as to evaluate their clinical significance.Methods:The BAG-l,EGFR,and PARP-1 expressions in a tissue microarray of invasive breast cancer and peritumoral tissues were detected through immunohistochemical staining.The clinical and pathological significance of BAG-1,EGFR,and PARP-1 were evaluated.Results:The BAG-1,EGFR,and PARP-1 expression levels are higher in invasive breast cancer tissues than in peritumoral tissues(P＜0.05).BAG-1 expression in invasive cancer tissues is not related to age,tumor site,lymph node metastases,and clinical TNM staging of patients,but is related to size,grade,ER,PR,and HER-2 expressions and molecular subtype(P＜0.05).EGFR expression is related to size,clinical TNM staging,and molecular subtype (P＜0.05).PARP-1 expression is related to grade,lymph node metastases,ER,and molecular subtype(P＜0.05).BAG-1 expression is not significantly correlated with EGFR and PARP-1 in all cases,but BAG-1 and PARP-1 expressions are positively correlated in triple-negative breast cancer tissues(P＜0.05).Results of the univariate analysis revealed that the BAG-1 and PARP-1 expressions and the molecular subtypes are associated with the prognoses of breast cancer patients.Multivariate analysis revealed that BAG-1 and PARP-1 expressions are factors that are independent of the prognosis.Conclusion:BAG-1,EGFR,and PARP-1 overexpressions in human breast tissues suggest that BAG-1,EGFR,and PARP-1 are related to breast cancer development.BAG-1,EGFR,and PARP-1 are potential biomarkers of breast cancer diagnosis and prognosis.

breast cancer,immunohistochemistry,BAG-1,epidermal growth factor receptor,poly(ADP-ribose)polymerase-l

10.3969/j.issn.1000-8179.20140116

王榮榮 碩士研究生。研究方向?yàn)槿橄侔┑脑缙谠\斷和靶向治療。

①天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院乳腺二科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津市300060）；②南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院

劉紅 lh713@163.com

E-mail：jr_wang1213@126.com