楊艷，王爽，黃麗燕，馬洪雨，舒英杰，何小玲，麻浩

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇南京210095

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

兩個大豆GmSBP基因的特征、亞細(xì)胞定位及對非生物脅迫的響應(yīng)

楊艷，王爽，黃麗燕，馬洪雨，舒英杰，何小玲，麻浩

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇南京210095

我國南方春大豆種子發(fā)育過程中，常處于高溫、高濕季節(jié)，加之種子本身富含蛋白(約40%)和脂肪(約20%)，導(dǎo)致南方春大豆種子易劣變。本項目組前期差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蔗糖結(jié)合蛋白在高溫高濕脅迫168 h時在種子田間劣變抗性品種湘豆3號發(fā)育種子中呈下調(diào)表達(dá)。為進(jìn)一步從分子水平了解GmSBP基因表達(dá)以及響應(yīng)高溫高濕脅迫的特性，本研究利用RT-PCR技術(shù)從大豆擴增出兩個GmSBP基因(GmSBP2和GmSBPL)。兩個基因編碼的蛋白均為親水性，不完整的膜蛋白。熒光定量PCR分析表明：在高溫高濕條件下，種子田間劣變不抗品種寧鎮(zhèn)1號和抗性品種湘豆3號發(fā)育種子中GmSBP2和GmSBPL基因表達(dá)量均受高溫高濕脅迫影響，也會導(dǎo)致種子中蔗糖和可溶性糖含量變化。在籽粒發(fā)育過程中，GmSBP2和GmSBPL基因表達(dá)量在花后30 d左右達(dá)到最高，對應(yīng)時期的蔗糖和可溶性糖含量也達(dá)到最大值。組織特異性顯示GmSBP和GmSBPL基因在不同組織間存在差異表達(dá)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明GmSBP2和Gm SBPL蛋白均定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。以上結(jié)果表明GmSBP2和GmSBPL基因可能參與了植物非生物脅迫的應(yīng)答過程，這將從一個側(cè)面豐富我們對大豆種子田間劣變性和劣變抗性的認(rèn)識。

大豆，SBP，基因分離，表達(dá)分析，亞細(xì)胞定位

種子生理成熟后，出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的質(zhì)量下降變化，稱為劣變(Seed deterioration)或者老化(Aging)。種子劣變具有不可逆、不可避免的特性[1]。不同品種種子老化速率不同[2]。種子劣變包括收獲前劣變和收獲后劣變。收獲前劣變主要是因為高溫高濕條件下加速生理生化變化導(dǎo)致種子的老化[3]，表現(xiàn)為細(xì)胞器的解體，酶活性下降，呼吸速率降低，DNA、RNA、蛋白質(zhì)等一些大分子物質(zhì)合成速率減慢，核糖體水解，膜完整性喪失，膜脂過氧化及代謝物質(zhì)滲漏等[4]。種子劣變會降低種子質(zhì)量、活力、貯藏力及田間出苗率從而造成難以估算的經(jīng)濟損失。中國南方春大豆種子收獲時正處于高溫、高濕季節(jié)，加之大豆(Glycine max(L.)Merr.)本身富含蛋白和脂肪，春大豆收獲前后及貯藏期間極易受環(huán)境影響而發(fā)生劣變，種子活力迅速下降。種子劣變已成為中國南方地區(qū)發(fā)展春大豆生產(chǎn)的重大障礙。

國內(nèi)外有關(guān)大豆種子劣變的研究主要集中在收獲及貯藏期間引起劣變的內(nèi)外誘因，野生與栽培大豆間劣變的差異程度，劣變過程中細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)和生理生化等變化以及劣變對農(nóng)藝性狀的影響等方面。對種子劣變的分子機制研究比較少。目前防止種子劣變的方法主要是通過改變貯藏條件，降低種子含水量等物理方法。大豆籽粒中碳水化合物含量約為30%左右，主要成分是蔗糖、乳糖和少量粗纖維。蔗糖是植物生長發(fā)育過程中的重要化合物之一，光合作用的主要產(chǎn)物，植物的能量載體，細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)因子，可能通過影響基因表達(dá)發(fā)揮作用，同時蔗糖具有信號功能[5-6]可以誘導(dǎo)或阻遏某些基因的表達(dá)[7]。蔗糖被認(rèn)為在信號傳導(dǎo)過程中參與了植物激素、磷酸鹽、光及逆境脅迫相關(guān)的過程[8]。國外學(xué)者通過對D-葡萄糖在光合作用和防御反應(yīng)的關(guān)系中所反應(yīng)出的相關(guān)代謝調(diào)節(jié)的影響研究時指出：碳水化合物作為一種信號分子，能夠在脅迫條件下激活細(xì)胞內(nèi)不同的信號途徑，最終，它們統(tǒng)一協(xié)調(diào)庫和源的代謝關(guān)系以激活防御系統(tǒng)[9]。因此研究植物蔗糖的代謝及生理生化規(guī)律是很有必要的。大豆種子中蔗糖積累受一系列因子的共同作用，如蔗糖的合成、運輸、分配及在種子中的代謝等，其中蔗糖在種子中的分解強度是增強庫強、提高糖卸載能力、保證新合成的蔗糖由源到庫不斷運輸?shù)闹匾h(huán)節(jié)[10]。在植物體中，蔗糖分子從源葉裝載進(jìn)入韌皮部及從韌皮部卸載進(jìn)入庫組織主要通過2種不同的途徑來進(jìn)行，即共質(zhì)體途徑和質(zhì)外體途徑[11]。質(zhì)外體途徑的裝載主要由蔗糖主動越膜裝載入韌皮部進(jìn)行運輸，然后在庫端越膜卸載進(jìn)入庫器官細(xì)胞。早期研究發(fā)現(xiàn)蔗糖的跨膜運輸及其在植物中的分配需要依賴于膜上的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白(Sucrose/H+cotransporters或sucrose transporters,SUCs或SUTs)，蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白在蔗糖轉(zhuǎn)運過程中起著極為重要的作用[12-14]。隨后發(fā)現(xiàn)一種新的參與蔗糖轉(zhuǎn)運的蛋白-蔗糖結(jié)合蛋白。蔗糖結(jié)合蛋白最初被發(fā)現(xiàn)是在子葉中與蔗糖類似物6-脫氧-6’-(4-疊氮-2羥基)-苯甲酰氨基-蔗糖有強親和力，而蔗糖類似物6-脫氧-6’-(4-疊氮-2羥基)-苯甲酰氨基-蔗糖能競爭性的抑制放射性標(biāo)記的蔗糖從大豆子葉進(jìn)入細(xì)胞原生質(zhì)體[15-16]。SBP基因在分子結(jié)構(gòu)上與SUT家族無關(guān)，結(jié)構(gòu)上與豌豆球蛋白類似[17]，屬于貯藏蛋白家族。有大量實驗證明其與植物蔗糖轉(zhuǎn)運有關(guān)[18]。例如在煙草細(xì)胞中抑制表達(dá)GmSBP，植物體表現(xiàn)出了與蔗糖轉(zhuǎn)運受損時相同的表型[19-20]。通過將GmSBP在SBP轉(zhuǎn)化酶缺失的酵母突變株系內(nèi)進(jìn)行異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞可以在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長[21]。

本項目組前期春大豆差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)蔗糖結(jié)合蛋白在高溫高濕脅迫168 h時在種子田間劣變抗性品種湘豆3號發(fā)育種子中呈下調(diào)表達(dá)[22]。本研究分離出與蔗糖轉(zhuǎn)運有關(guān)的兩個GmSBP基因，并進(jìn)行亞細(xì)胞定位，同時以種子田間劣變不抗品種寧鎮(zhèn)1號和抗性品種湘豆3號為材料，模擬田間高溫高濕條件，對其在逆境脅迫中的表達(dá)情況及其轉(zhuǎn)運產(chǎn)物含量變化進(jìn)行分析，以期從分子水平了解GmSBP基因表達(dá)及響應(yīng)高溫高濕脅迫的特性，為進(jìn)一步從一個側(cè)面揭示春大豆種子田間劣變的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)及脅迫處理

選用實驗室當(dāng)年保存的種子田間劣變不抗品種寧鎮(zhèn)1號和抗性品種湘豆3號種子，次氯酸鈉表面消毒，浸種1–2 h，25℃培養(yǎng)箱中催芽2–3 d，播種于裝有營養(yǎng)土的花盆中，置于室外生長。當(dāng)幼苗長出第一片三出復(fù)葉時，取根、莖、葉組織。隨后取盛花期的花。當(dāng)植株長到種子生理期(R7期)時，取一部分植株于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行高溫高濕處理：溫度40℃/30℃(白天/黑夜)，RH 100%/70%，光周期10 h/14 h，處理7 d。其他于室外正常生長作為對照組。分別取處理和對照組0、24、48、96、168 h的豆莢。室外生長的大豆于盛花期開始掛牌，當(dāng)天計為0 d，分別取盛花后15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d的豆莢。所有樣品立即置液氮中速凍，于–80℃保存?zhèn)溆?。?周苗齡的幼葉提取總RNA和基因組DNA。亞細(xì)胞定位材料為新鮮洋蔥表皮。

1.2 總DNA和RNA提取純化和cDNA的制備

采用CTAB法提取基因組總DNA。參照新型植物總RNA提取試劑盒說明書提取大豆材料的RNA。采用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑合成第一鏈cDNA，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 克隆引物的設(shè)計

從NCBI中搜索已經(jīng)公布的GmSBP基因序列，發(fā)現(xiàn)兩個蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因：GmSBP2 (GenBank Accession No.AY234869.1)和GmSBPL (GenBank Accession No.XM_003536582.1)。在基因上下游設(shè)計特異性引物(表1)，以DNA和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)總體積為25 μL，DNA/cDNA 2 μL，10×PCR緩沖液(Mg2+Free)2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 ng/μL基因特異引物2 μL，Taq DNA聚合酶0.25 μL，滅菌蒸餾水11.75 μL。PCR擴增程序為：95℃4 m in；4℃45 s，54/56/58/60℃45 s，72℃2 m in，30個循環(huán)；最后72℃10 m in。

將PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化、PCR菌液檢測后送測序。

1.4 GmSBP2和GmSBPL基因生物信息學(xué)分析

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進(jìn)行基因Blastx同源比對分析，通過ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.htm L)對GmSBPL和GmSBP2基因編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，利用TMHMM server v.2.0軟件對該基因的跨膜螺旋區(qū)域進(jìn)行分析。用DNA-MAN軟件對GmSBP2和GmSBPL基因進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化樹分析，用SoftBerry亞細(xì)胞定位軟件Prot-Comp 9.0在線分析GmSBPL和GmSBP2蛋白在細(xì)胞中的分布。

1.5 實時熒光定量PCR

以發(fā)育時期和高溫高濕脅迫處理的cDNA為模板，根據(jù)獲得的目的基因序列設(shè)計引物，以大豆actin基因作為對照，采用TaKaRa公司的SYBR Prem ix Ex TaqⅡ(Prefect real-time)試劑盒，Bio-RADiCycler實時熒光定量PCR儀進(jìn)行擴增。采用2–ΔΔCT算法分析實驗結(jié)果。

1.6 可溶性總糖、蔗糖含量測定

蒽酮硫酸法測定可溶性總糖，間苯二酚法測定蔗糖含量[23]。測定可溶性總糖時取發(fā)育時期及高溫高濕脅迫處理的樣品提取液0.1 m L加入5 m L蒽酮硫酸，90℃水浴15 m in，冷卻后620 nm比色。測定蔗糖時取樣品提取液0.1 m L加入0.1 m L NaOH，100℃水浴5 m in，冷卻后加入3.5 m L 30%HCl和1 m L 0.1%間苯二酚搖勻，80℃水浴10 m in，冷卻后480 nm比色。

1.7 Gm SBP2和Gm SBPL蛋白的亞細(xì)胞定位

為設(shè)計引物構(gòu)建融合表達(dá)載體，在GmSBP2和GmSBPL基因特異引物上游和下游分別引入Eco RⅠ與Bam HⅠ的酶切位點(表1)，從反轉(zhuǎn)的cDNA中擴增出帶有以上酶切位點的ORF片段，將片段從瓊脂糖膠回收后連接pMD-19 (TaKaRa)載體上，然后以Eco RⅠ和Bam HⅠ對連接載體進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳后回收片段與同樣雙酶切后線性化的pJIT166載體連接，獲得綠色熒光蛋白與目的基因的融合蛋白表達(dá)載體。

表1 本研究所用的引物Tab le 1 PCR Prim ers used in this study

取一塊長、寬大約4 cm的洋蔥幼嫩表皮，在固體MS培養(yǎng)基上22℃培養(yǎng)3–4 h。采用PDS-1000/He基因槍(Bio-Rad)轟擊洋蔥表皮細(xì)胞，可裂膜壓力為1 100 psi，轟擊距離約為5 cm。轟擊的洋蔥表皮細(xì)胞于22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14–16 h，于激光共聚焦顯微鏡下(Leica,TCS SP2)觀察GFP的表達(dá)定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因Gm SBP2和GmSBPL的cDNA和DNA的分離及生物信息學(xué)分析

以種子田間劣變不抗品種寧鎮(zhèn)1號和抗性品種湘豆3號cDNA為模板，利用特異引物GmSBP2-F/R和GmSBPL-F/R分離出大豆蔗糖結(jié)合蛋白基因GmSBP2和GmSBPL，兩個基因cDNA序列在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號兩個品種間沒有差異。測序結(jié)果同NCBI公布的GmSBP2 (AY234869.1)和GmSBPL(XM_003536582.1)基因進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)在GmSBP2基因中有兩個堿基不同(G→C，C→T)，導(dǎo)致編碼的蛋白中有兩個氨基酸不同，GmSBPL基因中有4個堿基不同(A→T，C→A，A→T，A→G)，編碼的蛋白中兩個氨基酸不同。

以湘豆3號葉片DNA為模板，進(jìn)行PCR擴增，分別得到3 110 bp的GmSBPL基因DNA序列和3 637 bp的GmSBP2基因DNA序列。測序結(jié)果與所得GmSBP2和GmSBPL基因的cDNA序列一致。

通過對GmSBP2和GmSBPL基因的cDNA序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)GmSBP2包含由1 467 bp核苷酸組成的完整ORF，編碼由489個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。GmSBPL包含由1 512 bp核苷酸組成的完整ORF，編碼504個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。采用Softberry網(wǎng)站的ProtComp 9.0預(yù)測GmSBP2和GmSBPL基因氨基酸序列，結(jié)果表明兩個基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞膜上。將比對獲得的GmSBP相關(guān)基因提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，利用Mega 5.0軟件進(jìn)行多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果表明，Law rence等鑒定出的類豌豆球蛋白中高度保守的26個氨基酸殘基[24]中GmSBP2和GmSBPL均出現(xiàn)23(88%)個。這些氨基酸殘基已經(jīng)被證明在維持蛋白三維結(jié)構(gòu)中有重要作用。將GmSBP2蛋白和GmSBPL蛋白序列與不同植物的同源蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，表明兩個基因編碼的蛋白與同屬豆科的苜蓿和蠶豆的SBP蛋白親緣關(guān)系最近。

2.2 GmSBP2和GmSBPL基因的表達(dá)模式分析

高溫高濕脅迫下，種子田間劣變不抗品種寧鎮(zhèn)1號和抗性品種湘豆3號發(fā)育種子中GmSBP2基因在不同脅迫時間點的表達(dá)量存在差異。脅迫處理0–48 h期間，相對于對照組，處理組寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號種子中GmSBP2基因表達(dá)量下降，但品種間基因表達(dá)量下降幅度不同。脅迫處理96–168 h，處理組寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號種子中GmSBP2基因表達(dá)量均上升(圖1)。

在種子發(fā)育過程中，從花后15 d開始寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號種子中GmSBP2基因表達(dá)量整體呈現(xiàn)單峰變化(圖2A)。為了明確GmSBP2基因在不同器官中的表達(dá)特征，檢測了它在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號各個主要器官中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GmSBP2基因在兩個品種中的根、莖、葉、盛花期花、幼莢中均能檢測到表達(dá)，其中在葉、盛花期花中兩個品種表達(dá)量最高，在莖中表達(dá)量最少(圖2B)。

高溫高濕脅迫下，種子田間劣變抗性品種湘豆3號發(fā)育種子中GmSBPL基因表達(dá)量在0?96 h低于對照組表達(dá)量；在168 h時，GmSBPL基因表達(dá)量與對照表達(dá)量相近。不抗品種寧鎮(zhèn)1號種子中在處理24 h時GmSBPL基因表達(dá)量低于對照組表達(dá)量，在處理48 h時GmSBPL基因表達(dá)量與對照組表達(dá)量一致，48 h后高于對照組的表達(dá)量(圖3)。

圖2 Gm SBP2基因的表達(dá)模式Fig.2 Expression verification of GmSBP2 gene.(A) The expression patterns of the GmSBP2 gene in developing seed of Ningzhen No.1 and Xiangdou No.3. (B)Real-time quantitative PCR analysis of GmSBP2 in different organs of Ningzhen No.1 and Xiangdou No.3. Vertical bars indicate±SE and values sharing a common letter are not significantly different at 0.05 level.

圖3 高溫高濕脅迫下Gm SBPL基因的表達(dá)Fig.3 Expression patterns of GmSBPL gene under high temperature and hum idity stress.Vertical bars indicate±SE and values sharing a common letter are not significantly different at 0.05 level.

在種子發(fā)育過程中，從花后15 d開始寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號種子中GmSBPL基因同GmSBP2基因表達(dá)量一樣整體呈現(xiàn)單峰變化即先上升后下降(圖4A)。GmSBPL基因在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號兩個品種中的根、莖、葉、盛花期花、幼莢中均能檢測到表達(dá)，其中在葉、盛花期花中兩個品種表達(dá)量最高，在根和莖中表達(dá)量最少(圖4B)。 2.3蔗糖和可溶性糖含量變化

圖4 Gm SBPL基因的表達(dá)模式Fig.4 Expression verification of GmSBPL gene.(A)The expression patterns of GmSBPL gene during seed development of Ningzhen No.1 and Xiangdou No.3.(B)Real-time quantitative PCR analysis of GmSBPL in different organs of Ningzhen No.1 and Xiangdou No.3.Vertical bars indicate±SE and values sharing a common letter are not significantly different at 0.05 level.

高溫高濕處理期間，種子田間劣變不抗品種寧鎮(zhèn)1號和抗性品種湘豆3號種子中蔗糖含量與對照相近，但在處理168 h時，寧鎮(zhèn)1號種子中蔗糖含量高于對照，而湘豆3號種子中蔗糖含量低于對照(圖5A)。在籽粒發(fā)育期間，寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號種子中蔗糖含量變化趨勢相同。在花后30 d左右，種子中蔗糖含量達(dá)到最大，花后30–40 d期間，蔗糖含量有下降趨勢，40 d后蔗糖含量基本趨于穩(wěn)定(圖5C)。可溶性糖含量與蔗糖含量變化趨勢基本一致(圖5B、D)。

2.4 Gm SBP2和Gm SBPL蛋白的亞細(xì)胞定位

采用基因槍將GmSBP2和GmSBPL基因亞細(xì)胞定位融合載體轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，用pJIT166表達(dá)載體作為對照。經(jīng)過培養(yǎng)后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖6，融合蛋白GmSBP2和GmSBPL主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上，而不含目的基因的對照GFP蛋白分布在整個細(xì)胞中(圖6)。

圖5 蔗糖及可溶性糖含量變化Fig.5 Changes of sucrose and soluble sugar.(A)The level of sucrose in the developing seeds of Ningzhen No.1 and Xiangdou No.3 under high temperature and hum idity stress.(B)The level of soluble sugar in the developing seeds of Ningzhen No.1 and Xiangdou No.3 under high temperature and hum idity stress.(C)The level of sucrose during seed development of Ningzhen No.1 and Xiangdou No.3.(D)The level of soluble sugar during seed development of Ningzhen No.1 and Xiangdou No.3.Vertical bars indicate±SE and values sharing a common letter are not significantly different at 0.05 level.

圖6 Gm SBP2：GFP和Gm SBPL：GFP在洋蔥表皮細(xì)胞的亞定位Fig.6 Subcellular localization of the Gm SBP2:GFP and Gm SBPL:GFP proteins in onion epidermal cells.

3 討論

蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物，蔗糖及其衍生物是大多數(shù)高等植物光合作用同化的碳的主要運輸形式。源葉片中的蔗糖合成后裝載入韌皮部中的篩管伴胞復(fù)合體(Sieve element companion cell complex,SECCC)，再經(jīng)過長距離運輸?shù)綆炱鞴賉15,25]。在植物體中，蔗糖分子從源葉裝載進(jìn)入韌皮部及從韌皮部卸載進(jìn)入庫組織主要通過2種不同的途徑來進(jìn)行，即共質(zhì)體途徑和質(zhì)外體途徑[11]。質(zhì)外體途徑的裝載需要依賴專一性的載體蛋白。蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白在蔗糖轉(zhuǎn)運過程中起著極為重要的作用[12-14]，同時也有研究證明蔗糖結(jié)合蛋白GmSBP也參與蔗糖的轉(zhuǎn)運，例如在煙草細(xì)胞中抑制表達(dá)GmSBP，植物體表現(xiàn)出了與蔗糖轉(zhuǎn)運受損時相同的表型[19-20]。通過將GmSBP在SBP轉(zhuǎn)化酶缺失的酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞可以在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長[21]。但蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白的其他功能沒有被研究。植物在生長發(fā)育過程中會遇到各種非生物脅迫，如高溫、干旱、冷害、鹽害鹽漬等，這些脅迫信號會誘導(dǎo)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化的變化。蔗糖的質(zhì)外體途徑裝載是蔗糖主動通過質(zhì)膜裝載在韌皮部的過程，依賴于H+-ATPase來提供能量[26]，也就是說蛋白的磷酸化影響蔗糖結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)運效率，間接調(diào)節(jié)了蔗糖的轉(zhuǎn)運。

蔗糖是植物體內(nèi)主要的糖成分，是植物體內(nèi)普遍存在的小分子物質(zhì)，能夠以類似植物激素的方式作為一種信號分子存在，調(diào)控多種基因的表達(dá)[27]。本研究分離得到兩個蔗糖結(jié)合蛋白基因GmSBP2和GmSBPL，生物信息學(xué)分析表明GmSBP2包含由1 467 bp核苷酸組成的完整ORF，編碼由489個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。GmSBPL包含由1 512 bp核苷酸組成的完整ORF，編碼504個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。采用Softberry網(wǎng)站的ProtComp 9.0預(yù)測GmSBP2和GmSBPL基因氨基酸序列，結(jié)果表明兩個基因編碼的蛋白定位于細(xì)胞膜上。將比對獲得的GmSBP相關(guān)基因提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，利用Mega 5.0軟件進(jìn)行多重序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。結(jié)果表明，Law rence等鑒定出的類豌豆球蛋白中高度保守的26個氨基酸殘基[24]中GmSBP2和GmSBPL均出現(xiàn)23(88%)個，屬于貯藏蛋白家族。

本項目組前期通過對中國南方92份春大豆種子進(jìn)行甲醇脅迫處理及溫箱蝕化處理，鑒定出種子田間劣變抗性品種湘豆3號和不抗品種寧鎮(zhèn)1號[28]。在此基礎(chǔ)上本實驗通過對目的基因GmSBP2和GmSBPL受高溫高濕脅迫表達(dá)模式進(jìn)行了分析，旨在探究其在大豆響應(yīng)脅迫反應(yīng)中的表現(xiàn)。相對于對照，高溫高濕脅迫下GmSBP2和GmSBPL基因表達(dá)量在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號大豆種子中呈差異表達(dá)，說明GmSBP2和GmSBPL基因可能參與了植物非生物脅迫的應(yīng)答過程，并且在調(diào)節(jié)過程中存在著差異。

本研究中，與對照相比，高溫高濕處理0–48 h期間種子田間劣變抗性品種湘豆3號種子中GmSBP2和GmSBPL基因表達(dá)量表現(xiàn)為下降；但隨著脅迫處理時間的延長(96–168 h)，GmSBP2基因表達(dá)量反而呈上升趨勢，而GmSBPL基因表達(dá)量繼續(xù)下降，直至在脅迫處理168 h時，與對照表達(dá)量相近。而高溫高濕處理前期和中期，抗性品種湘豆3號種子中蔗糖含量與相應(yīng)對照相近，但在處理168 h時，蔗糖含量顯著低于對照。對于種子田間劣變不抗品種寧鎮(zhèn)1號而言，其種子中GmSBP2和GmSBPL基因在脅迫處理0–48 h期間表達(dá)量相對于對照呈下降趨勢，但在脅迫處理96–168 h期間表達(dá)量上升。而高溫高濕處理前期和中期，不抗品種寧鎮(zhèn)1號種子中蔗糖含量與相應(yīng)對照相近，但在處理168 h時，寧鎮(zhèn)1號種子中蔗糖含量顯著高于對照。推測導(dǎo)致GmSBP2和GmSBPL基因表達(dá)與蔗糖含量之間這種狀況可能是因為：1)GmSBP2和GmSBPL基因在品種間功能大小差異；2)蔗糖轉(zhuǎn)化為蛋白、脂肪的能力存在品種間差異；3)蔗糖消耗存在品種間差異，這種消耗主要作為維持種子生長發(fā)育能量供應(yīng)以抵御高溫高濕脅迫。前期研究發(fā)現(xiàn)高溫高濕脅迫處理會降低種子的發(fā)芽率及發(fā)芽勢，使種子發(fā)生劣變，而抗性品種湘豆3號種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率下降幅度小于不抗品種寧鎮(zhèn)1號種子的下降幅度[30]。但GmSBP2和GmSBPL基因表達(dá)以及蔗糖含量變化與湘豆3號和寧鎮(zhèn)1號種子田間劣變程度之間關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

在籽粒發(fā)育過程中，GmSBP2和GmSBPL基因在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號種子中的表達(dá)量變化趨勢大致相同，在30 d左右達(dá)到最大值，寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號種子中蔗糖和可溶性糖含量在30 d左右也達(dá)到最大。組織特異性分析表明GmSBP2和GmSBPL基因在寧鎮(zhèn)1號和湘豆3號兩個品種中的根、莖、葉、盛花期花、幼莢中均能檢測到表達(dá)，其中在葉、盛花期花中兩個品種表達(dá)量最高，在莖中表達(dá)量最少。幼葉、幼莢均能進(jìn)行光合作用合成蔗糖，對應(yīng)蔗糖結(jié)合蛋白GmSBP2和GmSBPL基因表達(dá)量也高[31]。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示GmSBP2和GmSBPL基因編碼的蛋白主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，這表明GmSBP2和GmSBPL基因編碼的產(chǎn)物可能在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中行使其功能。

總之，大豆劣變性和抗劣變性是由多基因調(diào)控的復(fù)雜途徑，本文通過對GmSBP2和GmSBPL基因的特征、亞細(xì)胞定位及對非生物脅迫的響應(yīng)分析，以從一個側(cè)面豐富對其的認(rèn)識。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Characterization and subcellular localization of two SBP genes and their response to abiotic stress in soybean (Glycine max(L.)M err.)

Yan Yang,Shuang Wang,Liyan Huang,Hongyu M a,Yingjie Shu,Xiaoling He,and Hao M a
State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,Jiangsu,China

High temperature and hum idity stress during seed grow th and development of spring soybean can result in seed deterioration in South China.We isolated two genes(GmSBP and GmSBPL)encoding putative SBP proteins from soybean (Glycine max(L.)Merr.)to study their biological functions and response to abiotic stress,.The two SBP proteins are hydrophilic and incomplete membrane ones.Real-time quantitative(RT-PCR)analysis reveals that the expression of the two genes in the developing seeds of the seed deterioration resistant cultivar Xiangdou No.3 and sensitive cultivar Ningzhen No.1 was significantly affected by high temperature and hum idity treatment.Meanwhile,the levels of sucrose and soluble sugar in the developing seeds of both cultivars were also affected under high temperature and hum idity stress. During seed grow th and development,the expression of the two genes as well as the levels of sucrose and soluble sugar reached the highest at 30 days after flower.GmSBP2 and GmSBPL were found to be differentially expressed in different soybean tissues.Sub-cellular localization indicated that two genes were located in cytoplasm and cell membrane.Our results indicate that GmSBP2 and GmSBPL m ight be involved in the response to abiotic stress,which w ill enrich our understanding of pre-harvest seed deterioration and resistance in soybean from one side.

soybean,SBP protein,gene isolation,expression analysis,subcellular localization

March 5,2014;Accep ted:May 12,2014

Hao Ma.Tel/Fax:+86-25-84395324;E-mail:Lq-ncsi@njau.edu.cn

楊艷,王爽,黃麗燕,等.兩個大豆GmSBP基因的特征、亞細(xì)胞定位及對非生物脅迫的響應(yīng).生物工程學(xué)報,2014, 30(11):1709?1719.

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Suppo rted by:National Natural Science Foundation of China(Nos.30971840,31171572,31371711),The Research Fund for the Dectoral Program of Higher Education(Nos.20100097110030,20120097110025),the Shanghai Comm ittee of Agriculture,China(No.Hu 2013,No.1-2).

國家自然科學(xué)基金(Nos.30971840,31171572,31371711)，教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(Nos.20100097110030, 20120097110025)，上海市科技興農(nóng)推廣項目(No.Hu 2013,No.1-2)資助。

時間：2014-05-20網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140136.htm l