連接蛋白43在胎盤組織中的表達及與妊娠糖尿病的相關研究+付長霞+劉立昌+張春香+呂世軍

[摘要] 目的 觀察連接蛋白43（connexin43，Cx43）在妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）患者胎盤組織中的表達，探討Cx43及其構成的縫隙連接細胞間通訊（gap junctional intercellular communication，GJIC）在GDM胎盤組織中的作用。 方法 應用免疫組織化學法和Western blotting法檢測GDM未治療組（18例）、GDM治療組（22例）和正常妊娠組（12例）胎盤組織中Cx43的定位和表達。 結果 免疫組織化學染色顯示Cx43表達在滋養(yǎng)細胞的細胞漿及細胞膜。GDM未治療組Cx43陽性顆粒主要集中在細胞漿中，且明顯減少。GDM未治療組Cx43蛋白水平明顯低于其他兩組（P<0.05）。結論 Cx43在GDM未治療組的滋養(yǎng)細胞低表達，提示滋養(yǎng)細胞間GJIC異常，導致GDM胎盤滋養(yǎng)細胞間融合、分化異常， 可能與GDM的不良妊娠有關。

[關鍵詞] 妊娠糖尿?。惶ケP；連接蛋白43

[中圖分類號] R714.25 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）14-0045-03

妊娠糖尿病（gestational diaetes mellitus，GDM）是指妊娠首次發(fā)生和發(fā)現的不同程度的糖代謝異常，包括妊娠前已經存在但被漏診的孕前糖尿病者以及孕期伴隨發(fā)生的糖耐量異常者[1]?？p隙連接（gap junction，GJ）和細胞縫隙連接通訊（gap junction intercellular communication，GJIC）可以調控細胞增殖、細胞凋亡，參與細胞的生長抑制和轉化[2]。Cx43是連接蛋白基因家族中分布最廣、研究最多的一個連接蛋白。目前國內外文獻中鮮有關于Cx在GDM胎盤中表達情況的研究報道。本研究通過檢測Cx43在GDM孕婦胎盤中的表達，探討Cx43及其構成的GJIC對GDM胎盤發(fā)育的影響，為GDM的發(fā)病機制提供新的理論根據。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2011年7月～2012年6月于濰坊市中醫(yī)院產科住院分娩的婦女，均排除孕前有糖尿病病史。參考2010年美國糖尿病學會（American Diabetes Association，ADA）的診斷標準[3]將患者分為三組，GDM未治療組18例，GDM治療組22例，正常妊娠婦女12例，三組孕婦年齡、分娩孕周比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。三組孕婦均無煙酒嗜好，既往無高血壓、血液病、腎臟疾病、代謝性疾病等病史。

1.2 方法

1.2.1標本采集 三組孕婦均于胎盤娩出后胎盤稱重，直視下選取胎盤母面中央帶與中間帶組織（避開鈣化， 機化灶），將其分為兩部分：一部分切成約2.0 cm ×2.0 cm ×0.5 cm小塊組織，用4%福爾馬林固定，做石蠟切片；另一部分切成約0.5 cm3的小塊，置于DEPC處理過的凍存管中，標記后放入-70℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫組織化學染色 試劑來源：兔抗人Cx43多克隆抗體（1∶1000美國，Zyned），SP免疫組化染色試劑盒（北京中山生物技術公司），DAB顯示試劑盒（武漢博士德公司），APES粘片劑（北京中山生物技術公司）。免疫組化方法按試劑盒說明書進行。

1.2.3 Western blotting法檢測胎盤組織中Cx43蛋白的表達 提取胎盤絨毛組織蛋白，用考馬斯亮蘭法測定蛋白質濃度。制作12%的分離膠和5%的積層膠，每泳道上樣量20 μL，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h，加兔抗人Cx43多克隆抗體（1∶300 美國，Zyned） 4℃冰箱孵育過夜，TBST溶液搖床漂洗膜3次，每次15min。HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶1000 美國Zymed 公司） 室溫孵育2 h，同法洗膜3次，ECL發(fā)光試劑盒顯影、X線片感光后顯影定影，清水沖凈晾干。應用BiospectrumAC 凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。

1.3 結果判斷

1.3.1 Cx43的陽性判斷及分級標準 每張切片隨機觀察10個不重復的高倍（400×）視野，每個視野中根據滋養(yǎng)細胞的陽性細胞占觀察同類細胞總數的百分率分為：陰性（-）：陽性細胞<5%（0分），陽性（+）：細胞比較集中，陽性細胞5%～25%（1分）；（++）：陽性細胞為25%～75%（2分）；（+++）：陽性細胞>75%（3分）。細胞染色強度評分：陰性（0分）；淺黃色為弱陽性+（1分）；棕黃色為陽性++（2分）；細胞呈棕褐色為強陽性（+++）（3分）。Cx43評分=細胞染色率評分+細胞染色強度評分。0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為陽性，5～6分為強陽性。

1.3.2 Western blotting結果判定 應用BiospectrumAC 凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、用凝膠定量軟件Quantity One測定各組目的蛋白和β-actin的積分灰度值。數據處理時用各組積分灰度值除以內參照β-actin條帶的積分灰度值獲得相對積分灰度值的比值，用均數±標準差表示。

1.4 統(tǒng)計學分析

運用 SAS8.0統(tǒng)計學軟件進行數據處理和分析，其中計數資料采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，計量資料采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1免疫組織化學染色

2.1.1觀察Cx43在胎盤滋養(yǎng)細胞表達的定位 利用免疫組織化學方法檢測Cx43在GDM未治療組、GDM治療組及正常對照組胎盤滋養(yǎng)細胞中表達，在絨毛細胞滋養(yǎng)細胞、合體滋養(yǎng)細胞和血管內皮細胞的細胞膜上可見棕色顆粒，呈線性排列，在細胞漿上可見少數棕色顆粒。實驗結果顯示：Cx43表達于絨毛滋養(yǎng)層細胞、絨毛間質纖維細胞和血管內皮細胞，且在滋養(yǎng)細胞的細胞膜上表達最為明顯（圖1、2、3）。

2.1.2三組胎盤Cx43的免疫組化及分析 本研究中三組Cx43蛋白表達結果顯示為Cx43+，Cx43++，Cx43+++，無陰性表達（表1）。對三組的胎盤滋養(yǎng)細胞的表達強度進行分析，經Kruskal-Wallis秩和檢驗，差異有顯著性（Hc=15.04，P=0.0005），說明三組的Cx43蛋白在胎盤滋養(yǎng)細胞的表達強度不同。其中GDM未治療組與GDM治療組表達強度差異有顯著性（秩次之差為14.306，P<0.05），GDM未治療組表達強度低于GDM治療組；GDM未治療組與正常對照組表達強度差異有顯著性（秩次之差為18.431，P<0.05），GDM未治療組表達強度低于正常對照組；GDM治療組與正常對照組表達強度差異無統(tǒng)計學意義（秩次之差為4.125，P>0.05）。

2.2 Western blotting法分析Cx43蛋白的表達

取三組胎盤組織的總蛋白各10 μL做免疫印跡，檢測Cx43（43KD）表達水平。以分子量為36KD羊抗人抗β-actin單克隆抗體為內參照。Cx43蛋白水平在三組標本中均存在表達（圖4）。各組胎盤組織的相對積分灰度值比值用均數±標準差表示。各組總體均數比較結果，見表2。

3 討論

GDM是妊娠期最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且各國報道不一，約1.7%～11.6%[4]。有研究[5]表明患GDM婦女發(fā)展成為2型糖尿病的風險極高，其后代在19～27歲之間發(fā)展成為糖尿病或糖耐量異常的幾率增高8倍。GDM對后代的負面影響包括：肥胖、胰島素缺陷等[6]。GDM導致的近期及遠期母嬰并發(fā)癥的危害極大，故GDM一直為醫(yī)學界所關注。

Cx43是Cx基因家族中數量最為豐富的成員，迄今已發(fā)現存在于34種組織和46種細胞中[7]。各類Cx分子序列和長度上的差別主要在羧基末端和胞內環(huán)部分，它們決定了所組成的GJ具有不同的理化和調節(jié)特性。

本研究免疫組織化學結果顯示Cx43在正常對照組主要定位于細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞的細胞膜上，細胞漿也有表達，但在GDM未治療組卻發(fā)現Cx43表達主要在細胞漿表達，而且表達減少。據此推測是由于Cx43定位異常所致。Cx定位異常即Cx由細胞膜轉移至細細胞漿、細胞核或細胞膜的其他部位，這樣將導致Cx在錯誤定位處無法與鄰近細胞形成粘附。

Cx43蛋白在GDM未治療組較GDM未治療組和正常對照組的胎盤組織中的表達明顯減少，原因可能是Cx43基因在轉錄前或是轉錄過程中發(fā)生了改變，也可能與轉錄后的翻譯或是翻譯后蛋白質的加工修飾過程異常相關[8]。GDM胎盤中Cx43蛋白的表達下調，可能直接影響GJ的形成，導致GJIC異常，機體對CTs的監(jiān)視和調控能力減弱，滋養(yǎng)細胞會過度克隆生長，這可能是GDM形成過程中造成胎盤改變的重要分子機制之一。GJIC是維持細胞正常增殖、分化及凋亡的重要因素，在GJIC的眾多調控環(huán)節(jié)中任何一處異常均會導致細胞生長失控。滋養(yǎng)細胞中GJIC異常機制及這種異常如何影響滋養(yǎng)細胞的增殖、融合和分化等發(fā)生發(fā)展的研究才剛剛起步，深入研究GJIC在GDM發(fā)生時的異常機制，闡明GJIC對滋養(yǎng)細胞生長調控的原理，將會使人們更深入地認識GDM發(fā)生發(fā)展的原因，為GDM的防治提供更多的新靶點。

本研究通過觀察Cx43表達與GDM胎盤發(fā)病機制的關系，為進一步闡明GDM的發(fā)病機制提供理論依據。發(fā)現在早期治療的GDM孕婦胎盤中Cx43的表達與正常妊娠組的表達無差異，說明提高早期診治對GDM發(fā)展具有重要意義，也有文獻[9]指出孕前或孕中參與體育活動可能會降低患GDM的風險，建議每天進行30 min以上中等強度的體育鍛煉。

[參考文獻]

[1] American Diabetes Association. Standards of medical care

2.1.2三組胎盤Cx43的免疫組化及分析 本研究中三組Cx43蛋白表達結果顯示為Cx43+，Cx43++，Cx43+++，無陰性表達（表1）。對三組的胎盤滋養(yǎng)細胞的表達強度進行分析，經Kruskal-Wallis秩和檢驗，差異有顯著性（Hc=15.04，P=0.0005），說明三組的Cx43蛋白在胎盤滋養(yǎng)細胞的表達強度不同。其中GDM未治療組與GDM治療組表達強度差異有顯著性（秩次之差為14.306，P<0.05），GDM未治療組表達強度低于GDM治療組；GDM未治療組與正常對照組表達強度差異有顯著性（秩次之差為18.431，P<0.05），GDM未治療組表達強度低于正常對照組；GDM治療組與正常對照組表達強度差異無統(tǒng)計學意義（秩次之差為4.125，P>0.05）。

2.2 Western blotting法分析Cx43蛋白的表達

取三組胎盤組織的總蛋白各10 μL做免疫印跡，檢測Cx43（43KD）表達水平。以分子量為36KD羊抗人抗β-actin單克隆抗體為內參照。Cx43蛋白水平在三組標本中均存在表達（圖4）。各組胎盤組織的相對積分灰度值比值用均數±標準差表示。各組總體均數比較結果，見表2。

3 討論

GDM是妊娠期最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且各國報道不一，約1.7%～11.6%[4]。有研究[5]表明患GDM婦女發(fā)展成為2型糖尿病的風險極高，其后代在19～27歲之間發(fā)展成為糖尿病或糖耐量異常的幾率增高8倍。GDM對后代的負面影響包括：肥胖、胰島素缺陷等[6]。GDM導致的近期及遠期母嬰并發(fā)癥的危害極大，故GDM一直為醫(yī)學界所關注。

Cx43是Cx基因家族中數量最為豐富的成員，迄今已發(fā)現存在于34種組織和46種細胞中[7]。各類Cx分子序列和長度上的差別主要在羧基末端和胞內環(huán)部分，它們決定了所組成的GJ具有不同的理化和調節(jié)特性。

本研究免疫組織化學結果顯示Cx43在正常對照組主要定位于細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞的細胞膜上，細胞漿也有表達，但在GDM未治療組卻發(fā)現Cx43表達主要在細胞漿表達，而且表達減少。據此推測是由于Cx43定位異常所致。Cx定位異常即Cx由細胞膜轉移至細細胞漿、細胞核或細胞膜的其他部位，這樣將導致Cx在錯誤定位處無法與鄰近細胞形成粘附。

Cx43蛋白在GDM未治療組較GDM未治療組和正常對照組的胎盤組織中的表達明顯減少，原因可能是Cx43基因在轉錄前或是轉錄過程中發(fā)生了改變，也可能與轉錄后的翻譯或是翻譯后蛋白質的加工修飾過程異常相關[8]。GDM胎盤中Cx43蛋白的表達下調，可能直接影響GJ的形成，導致GJIC異常，機體對CTs的監(jiān)視和調控能力減弱，滋養(yǎng)細胞會過度克隆生長，這可能是GDM形成過程中造成胎盤改變的重要分子機制之一。GJIC是維持細胞正常增殖、分化及凋亡的重要因素，在GJIC的眾多調控環(huán)節(jié)中任何一處異常均會導致細胞生長失控。滋養(yǎng)細胞中GJIC異常機制及這種異常如何影響滋養(yǎng)細胞的增殖、融合和分化等發(fā)生發(fā)展的研究才剛剛起步，深入研究GJIC在GDM發(fā)生時的異常機制，闡明GJIC對滋養(yǎng)細胞生長調控的原理，將會使人們更深入地認識GDM發(fā)生發(fā)展的原因，為GDM的防治提供更多的新靶點。

本研究通過觀察Cx43表達與GDM胎盤發(fā)病機制的關系，為進一步闡明GDM的發(fā)病機制提供理論依據。發(fā)現在早期治療的GDM孕婦胎盤中Cx43的表達與正常妊娠組的表達無差異，說明提高早期診治對GDM發(fā)展具有重要意義，也有文獻[9]指出孕前或孕中參與體育活動可能會降低患GDM的風險，建議每天進行30 min以上中等強度的體育鍛煉。

[參考文獻]

[1] American Diabetes Association. Standards of medical care

2.1.2三組胎盤Cx43的免疫組化及分析 本研究中三組Cx43蛋白表達結果顯示為Cx43+，Cx43++，Cx43+++，無陰性表達（表1）。對三組的胎盤滋養(yǎng)細胞的表達強度進行分析，經Kruskal-Wallis秩和檢驗，差異有顯著性（Hc=15.04，P=0.0005），說明三組的Cx43蛋白在胎盤滋養(yǎng)細胞的表達強度不同。其中GDM未治療組與GDM治療組表達強度差異有顯著性（秩次之差為14.306，P<0.05），GDM未治療組表達強度低于GDM治療組；GDM未治療組與正常對照組表達強度差異有顯著性（秩次之差為18.431，P<0.05），GDM未治療組表達強度低于正常對照組；GDM治療組與正常對照組表達強度差異無統(tǒng)計學意義（秩次之差為4.125，P>0.05）。

2.2 Western blotting法分析Cx43蛋白的表達

取三組胎盤組織的總蛋白各10 μL做免疫印跡，檢測Cx43（43KD）表達水平。以分子量為36KD羊抗人抗β-actin單克隆抗體為內參照。Cx43蛋白水平在三組標本中均存在表達（圖4）。各組胎盤組織的相對積分灰度值比值用均數±標準差表示。各組總體均數比較結果，見表2。

3 討論

GDM是妊娠期最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且各國報道不一，約1.7%～11.6%[4]。有研究[5]表明患GDM婦女發(fā)展成為2型糖尿病的風險極高，其后代在19～27歲之間發(fā)展成為糖尿病或糖耐量異常的幾率增高8倍。GDM對后代的負面影響包括：肥胖、胰島素缺陷等[6]。GDM導致的近期及遠期母嬰并發(fā)癥的危害極大，故GDM一直為醫(yī)學界所關注。

Cx43是Cx基因家族中數量最為豐富的成員，迄今已發(fā)現存在于34種組織和46種細胞中[7]。各類Cx分子序列和長度上的差別主要在羧基末端和胞內環(huán)部分，它們決定了所組成的GJ具有不同的理化和調節(jié)特性。

本研究免疫組織化學結果顯示Cx43在正常對照組主要定位于細胞滋養(yǎng)細胞和合體滋養(yǎng)細胞的細胞膜上，細胞漿也有表達，但在GDM未治療組卻發(fā)現Cx43表達主要在細胞漿表達，而且表達減少。據此推測是由于Cx43定位異常所致。Cx定位異常即Cx由細胞膜轉移至細細胞漿、細胞核或細胞膜的其他部位，這樣將導致Cx在錯誤定位處無法與鄰近細胞形成粘附。

Cx43蛋白在GDM未治療組較GDM未治療組和正常對照組的胎盤組織中的表達明顯減少，原因可能是Cx43基因在轉錄前或是轉錄過程中發(fā)生了改變，也可能與轉錄后的翻譯或是翻譯后蛋白質的加工修飾過程異常相關[8]。GDM胎盤中Cx43蛋白的表達下調，可能直接影響GJ的形成，導致GJIC異常，機體對CTs的監(jiān)視和調控能力減弱，滋養(yǎng)細胞會過度克隆生長，這可能是GDM形成過程中造成胎盤改變的重要分子機制之一。GJIC是維持細胞正常增殖、分化及凋亡的重要因素，在GJIC的眾多調控環(huán)節(jié)中任何一處異常均會導致細胞生長失控。滋養(yǎng)細胞中GJIC異常機制及這種異常如何影響滋養(yǎng)細胞的增殖、融合和分化等發(fā)生發(fā)展的研究才剛剛起步，深入研究GJIC在GDM發(fā)生時的異常機制，闡明GJIC對滋養(yǎng)細胞生長調控的原理，將會使人們更深入地認識GDM發(fā)生發(fā)展的原因，為GDM的防治提供更多的新靶點。

本研究通過觀察Cx43表達與GDM胎盤發(fā)病機制的關系，為進一步闡明GDM的發(fā)病機制提供理論依據。發(fā)現在早期治療的GDM孕婦胎盤中Cx43的表達與正常妊娠組的表達無差異，說明提高早期診治對GDM發(fā)展具有重要意義，也有文獻[9]指出孕前或孕中參與體育活動可能會降低患GDM的風險，建議每天進行30 min以上中等強度的體育鍛煉。

[參考文獻]

[1] American Diabetes Association. Standards of medical care