盧 燕，張 強(qiáng)

白細(xì)胞介素8對胃腺癌HGC-27細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

盧 燕1，張 強(qiáng)2

目的 探討白細(xì)胞介素-8(IL-8)對胃腺癌(HGC-27)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響及其可能機(jī)制。方法 選擇一定濃度的IL-8體外刺激培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化特征;實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western blot分別檢測IL-8刺激前后與EMT相關(guān)標(biāo)志分子E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的mRNA及蛋白表達(dá);平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell法分別檢測IL-8刺激前后HGC-27細(xì)胞的遷移和細(xì)胞克隆變化。結(jié)果 IL-8能誘導(dǎo)HGC-27細(xì)胞發(fā)生類似成纖維狀改變，其中部分細(xì)胞表現(xiàn)出典型的梭形;實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western blot結(jié)果表明:IL-8可在分子及蛋白水平上誘使HGC-27細(xì)胞與EMT相關(guān)標(biāo)志分子E-cadherin表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)均明顯增加(P值均小于0.05);Transwell及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)也分別顯示IL-8可增強(qiáng)HGC-27細(xì)胞克的隆形成和遷移能力(P值均小于0.05)。結(jié)論 IL-8可從形態(tài)及功能上誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變，具有增強(qiáng)腫瘤進(jìn)一步惡化的潛能。

胃腫瘤;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;白細(xì)胞介素-8

研究［1］認(rèn)為，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial－mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞源性腫瘤細(xì)胞獲得侵襲遷移能力的重要生物學(xué)過程，在惡性腫瘤的形成與發(fā)展中扮演著十分重要的角色，是腫瘤進(jìn)展的始動機(jī)制之一。目前認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞的EMT效應(yīng)受炎性腫瘤微環(huán)境中各種生物活性因子的調(diào)控［2］。IL-8屬于趨化因子超家族的一員，在多種因素刺激下，多種細(xì)胞可產(chǎn)生。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，IL-8在胃癌患者血清及癌組織中大量存在，并與胃癌的轉(zhuǎn)移或惡化過程有關(guān)［3］。那么這一過程是否與EMT現(xiàn)象有關(guān)，目前少有報(bào)道。本文以IL-8作用后的胃癌細(xì)胞株HGC-27為研究對象，以胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象為切入點(diǎn)，初步探討IL-8對胃癌細(xì)胞遷移等生物學(xué)效應(yīng)的影響及可能的機(jī)制，希望為以IL-8及其受體為靶點(diǎn)的胃癌的預(yù)防及臨床治療提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 人未分化胃癌細(xì)胞株HGC-27(中科院上海細(xì)胞庫);IL-8(72aa，美國PEPROTECHEC公司)。鼠抗人抗體N-cadherin、E－cadherin、Vimentin及β-actin等單克隆抗體(Bioworld公司);Trizol(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(ToYoBo公司);熒光定量PCR試劑盒(CWBIO);BCA法蛋白測量試劑盒(康為公司);DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司);Rotor-Gene 6000熒光定量PCR儀(Corbett公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌HGC-27細(xì)胞復(fù)蘇后于含10%胎牛血清，100 u/ml青霉素及100 u/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 IL-8刺激培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞 取對數(shù)生長期HGC-27細(xì)胞，以3×105/瓶，接種于培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)分兩組:對照組，含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)組:含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基+IL-8(100 ng/mL)。置于37℃，5%CO2孵育箱中培養(yǎng)96 h。倒置顯微鏡觀察HGC-27細(xì)胞形態(tài)。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄 將上述條件下，培養(yǎng)96 h的HGC-27細(xì)胞分別用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，各取總量為1×106的細(xì)胞分別加入一定量的Trizol，按Trizol試劑說明書操作提取總RNA，用核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司)測定濃度。用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳法檢測其純度和完整性;然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量RT－PCR參照文獻(xiàn)［4］用Primer Express3.0軟件跨外顯子設(shè)計(jì)E-cadherin、N-cadherin和Vimentin內(nèi)參基因β-actin引物序列，由上海生工公司合成。反應(yīng)總體系25 μL:2×Sybrgreen mix 10μL，10 pmol/μL上、下游引物各0.4 μL，cDNA樣本1 μL，ddH2O補(bǔ)足到25 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，各引物的退火溫度72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃～90℃收集熒光;72℃再延伸5 min，在72℃～99℃用軟件(Rotor-Gene 6000軟件)進(jìn)行熔解曲線自動分析。用公式:目的基因表達(dá)水平=(目的基因copies/μL)/(β-actin copies/μL)計(jì)算并分析，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

圖1 IL-8刺激HGC-27細(xì)胞96h后的形態(tài)變化(×100)。

圖2 IL-8對HGC－27細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志分子蛋白表達(dá)的影響

圖3 IL－8對胃癌細(xì)胞HGC-27株遷移能力的影響(×100) 注:以100 ng/mL IL-8刺激HGC-27細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組(B)細(xì)胞遷移數(shù)較對照組(A)明顯增多(t=2.944，P＜0.05)。

圖4 IL-8對HGC-27細(xì)胞克隆形成能力的影響 注:平板克隆實(shí)驗(yàn)照片，A對照組;B實(shí)驗(yàn)組。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法 配制100 g/L SDS-PGAE電泳凝膠，將上述對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各取1×106個(gè)，用裂解液(RIPA buffer，康為公司)進(jìn)行充分裂解，4℃12 000 r/min離心15 min，收集上清，用BCA法測定蛋白濃度，再加入等體積的2× SDS上樣緩沖液，煮沸5 min左右。按150 μg/孔的蛋白總量加樣并進(jìn)行SDS-PGAE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，再分別用鼠抗人E-cadherin(1:400)、N-cadherin (1:2 000)、Vimentin(1:500)及免抗人β-actin(1:5 000)等單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的特異性二抗37℃孵育1 h，再洗膜，用ChemGelDoc成像儀(Bio-Rad)分析并處理結(jié)果。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期HGC-27細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度2.5×105/mL，按200 μL/孔的細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，下室分別加入含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基(對照組)和含10%胎牛血清及100 ng/ mLIL-8的高糖DMEM培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)組)。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，37℃，5%CO2孵育箱培養(yǎng)8 h，取出Transwell小室，用棉簽輕輕抹去聚碳酸酯膜上表面的細(xì)胞，PBS漂洗3～4次，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)穿過膜細(xì)胞，取均值，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 平板克隆實(shí)驗(yàn) IL-8(50 ng/mL)刺激培養(yǎng)胃癌細(xì)胞HCG-27 96 h后，以未作處理的HGC-27細(xì)胞為對照，分別消化計(jì)數(shù)后，接種于6孔板內(nèi)，每孔接種的細(xì)胞數(shù)2×103，實(shí)驗(yàn)組與對照組再分別用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，培養(yǎng)14 d后，PBS洗3～4次，4%多聚甲醛固定15 min。結(jié)晶紫染色15 min，PBS再洗3～4次，分別拍照并計(jì)數(shù)2組細(xì)胞克隆數(shù)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 IL-8 對HGC-27細(xì)胞形態(tài)變化的影響 在100 ng/mL的IL-8刺激培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞96h(實(shí)驗(yàn)組)后，鏡下觀察到HGC-27細(xì)胞形態(tài)較正常對照組(圖1A)變的細(xì)長，類似成纖維狀，細(xì)胞排列較為松散雜亂，部分細(xì)胞呈典型梭形(圖1B)。

2.2 IL-8對HGC-27細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志分子表達(dá)的影響實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，IL-8作用后的HGC-27細(xì)胞與EMT相關(guān)的標(biāo)志分子E-cadherin在mRNA及蛋白水平表達(dá)均下降，而N-cadherin和Vimentin表達(dá)均升高(見圖2及表1)。2.3 IL-8促進(jìn)HGC-27細(xì)胞遷移和克隆形成 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組(IL-8刺激組:207.00±25.93，圖3B)較對照組(IL－8未刺激組:114.3±23.09，圖3A)細(xì)胞遷移數(shù)明顯增多(t=2.944，P＜0.05);平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:IL-8具有增強(qiáng)胃癌細(xì)胞HGC-27克隆形成的能力(實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞克隆數(shù)(100.50±12.58)較對照組(49.67±10.68)明顯增多(t=3.049，P＜0.05)。見圖4。

表1 IL-8刺激培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞96 h對EMT相關(guān)標(biāo)志分子mRNA表達(dá)的影響(±s，n=3)

表1 IL-8刺激培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞96 h對EMT相關(guān)標(biāo)志分子mRNA表達(dá)的影響(±s，n=3)

IL-8 (ng/mL) E-鈣粘蛋白(×10－1) N-鈣粘蛋白(×10－2)波形蛋白(×10－1) 12.33 3.056 3.306 P值0 2.13±0.12 4.97±1.02 2.00±0.29 100 0.24±0.09 16.00±3.46 7.67±1.69 t值＜0.01 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

胃癌是危害人類生命健康的常見惡性腫瘤之一，其病死率在我們國家居第2位［5］。導(dǎo)致其病死率居高不下的主要原因之一，就是胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素參與，多步驟的復(fù)雜過程，而癌細(xì)胞的EMT現(xiàn)象可能是其重要的環(huán)節(jié)之一。上皮細(xì)胞的多形性改變和去極化是腫瘤發(fā)展的重要標(biāo)志，被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展或進(jìn)一步惡化的始動機(jī)制之一，現(xiàn)有研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞EMT效應(yīng)的發(fā)生除與細(xì)胞本身的生物學(xué)性狀改變有關(guān)外［6］，更與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)，其中起主要作用的可能是一些具有生物學(xué)活性的細(xì)胞因子［7］。大量的研究資料表明，趨化因子IL-8作為一種多功能細(xì)胞因子在正常胃粘膜組織不表達(dá)或少量表達(dá)，但在胃癌發(fā)生時(shí)，其表達(dá)量可明顯增加［3，8］，可見IL-8在腫瘤特別是胃癌的發(fā)生或發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重大的作用。但是，目前對IL-8在腫瘤特別是胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其機(jī)制的認(rèn)識還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

我們以體外IL-8作用后的胃癌細(xì)胞HGC-27為研究對對象，從胃癌細(xì)胞的EMT現(xiàn)象入手，分析IL-8在胃癌進(jìn)一步發(fā)展中的作用。研究結(jié)果顯示，一定濃度的IL-8刺激培養(yǎng)HGC-27細(xì)胞一段時(shí)間后，可促使HGC-27細(xì)胞形態(tài)由正常的多邊樣上皮形態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維細(xì)胞樣形態(tài)，其中個(gè)別細(xì)胞表現(xiàn)出梭形，呈典型的間質(zhì)細(xì)胞樣的形態(tài)特點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果也顯示:IL-8刺激培養(yǎng)后的HGC-27細(xì)胞與EMT相關(guān)的標(biāo)志分子上皮鈣粘著蛋白(E-cadherin)在基因及蛋白水平表達(dá)均下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如N-cadherin 和Vimentin表達(dá)分別上調(diào)。以上結(jié)果表明:IL-8可促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生類似EMT樣的改變，而腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT樣改變往往被看作是其進(jìn)一步惡化的表現(xiàn)之一［9］。據(jù)此，我們推測胃癌微環(huán)境中IL-8具有促進(jìn)胃癌進(jìn)一步惡化潛能，其方式之一是促進(jìn)癌細(xì)胞EMT效應(yīng)的發(fā)生。

已有研究表明，腫瘤細(xì)胞在發(fā)生EMT現(xiàn)象的同時(shí)，往往伴隨有其它生物學(xué)性狀的改變，如:侵襲遷移能力，增殖或干性能力增強(qiáng)等。那么IL-8作用后的胃癌細(xì)胞在發(fā)生EMT現(xiàn)象時(shí)，是否也有類似的變化?Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-8作用后的HGC-27細(xì)胞在發(fā)生EMT樣改變的同時(shí)，也獲得了更強(qiáng)的侵襲遷移能力。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移既是腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)一步惡化的重要標(biāo)志之一，也是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過程，在這一過程中，腫瘤細(xì)胞的獨(dú)立存活或較強(qiáng)的增殖能力顯得尤為重要［10］?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-8刺激培養(yǎng)的HGC-27細(xì)胞，在發(fā)生EMT樣改變后，其克隆形成能力也顯著增強(qiáng)。結(jié)合相關(guān)［11］報(bào)道，腫瘤細(xì)胞在發(fā)生EMT現(xiàn)象時(shí)，可獲得部分干性或干性增強(qiáng)，因此以上結(jié)果表明:IL-8在誘使胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣變化的同時(shí)，還具有增強(qiáng)癌細(xì)胞自我更新的能力。

綜上所述，IL-8具有增強(qiáng)胃癌細(xì)胞侵襲遷移的能力及促進(jìn)胃癌進(jìn)一步惡化的潛能，其作用的方式之一可能是通過誘使胃癌細(xì)胞發(fā)生EMT樣的改變來實(shí)現(xiàn)的。因此深入研究IL-8在胃癌進(jìn)一步惡化中的作用，可為針對IL-8及其受體為靶標(biāo)的胃癌治療提供新思路，使從腫瘤微環(huán)境角度控制胃癌的進(jìn)一步發(fā)展成為可能。

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R735.2

A

1008-7044(2014)05-0458-03

2014-05-05)

1.安徽省蚌埠市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，233030;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽蚌埠233004

盧 燕(1970－)，女，安徽蚌埠市人，檢驗(yàn)師，大專。