楊繼要，劉國紅，劉德義，丁 一，王 靜

（1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河南鄭州450001；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，河南鄭州450052）

肺腺癌血清腫瘤標志物的篩選與鑒定

楊繼要1，劉國紅1，劉德義2，丁 一1，王 靜2

（1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河南鄭州450001；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，河南鄭州450052）

目的應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選肺腺癌患者血清中的腫瘤標志物。方法收集8例肺腺癌患者及8例正常人血清，剔除血清中白蛋白干擾后，得到血清可溶性總蛋白并采用雙向電泳方法分離，獲得血清蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜，經(jīng)PDQuest7.1凝膠圖像軟件分析找出表達差異的蛋白點，經(jīng)基質(zhì)輔助電離解析飛行時間質(zhì)譜檢測獲得待測蛋白的肽質(zhì)量指紋圖譜，通過搜尋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫鑒定出肺腺癌血清中候選的腫瘤相關(guān)蛋白。結(jié)果建立了肺腺癌患者及正常人血清蛋白質(zhì)表達譜。經(jīng)軟件匹配分析，共篩選出24個差異的蛋白點，從中選出差異顯著的7個蛋白點進行質(zhì)譜分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢分析，成功的鑒定出5種蛋白質(zhì)：凝聚素、觸珠蛋白、血清淀粉樣蛋白A、血清白蛋白A鏈、纖維膠凝蛋白3。結(jié)論本研究建立了人肺腺癌患者及正常人血清的雙向電泳圖譜；鑒定出了若干肺癌相關(guān)蛋白質(zhì)，為進一步尋找肺癌蛋白標志物奠定了基礎(chǔ)。

肺腺癌；血清；雙向凝膠電泳；基質(zhì)輔助電離解析飛行時間質(zhì)譜；蛋白質(zhì)組

肺癌嚴重危害人類健康，早期診斷是提高肺癌生存率的關(guān)鍵［1］，對改善肺癌預(yù)后及生存狀況具有重要意義。從肺癌血清中尋找與疾病發(fā)生、發(fā)展過程相關(guān)的敏感蛋白質(zhì)分子，用于作為肺癌診斷及預(yù)后評估的血清標志物，將是提高肺癌早期診斷率的有效途徑。蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法為該途徑提供了有力的技術(shù)支持［2］。本實驗應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，成功構(gòu)建了分辨率高、重復(fù)性好的肺腺癌患者及正常血清雙向凝膠電泳的蛋白質(zhì)圖譜，并鑒定出其中存在差異的蛋白質(zhì)，為尋找肺癌特異性的診斷指標提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料入組8例肺腺癌患者及8例正常人血清均取自2006年至2009年鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肺癌患者，均經(jīng)過病理學(xué)鑒定為肺腺癌。IPG預(yù)制干膠條（pH3～10 17 cm）、兩性電解質(zhì)（Bio-lyte Ampholyte 3～10）、礦物油購自美國Bio-Rad公司，四甲基乙二胺、碘乙酰胺、Tris-Base、二硫蘇糖醇、CHAPS購自美國Sigma公司，雙向電泳系統(tǒng)、Gs-800圖像獲取儀、PDQuest 7.1凝膠圖像分析軟件均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。SwellGel?Blue白蛋白去除試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 血清白蛋白去除按照試劑盒說明進行操作，采用Bradford法測定血清總蛋白濃度，分裝后-80℃凍存，用于雙向電泳分析。

1.3 固相17 cm pH（3～10）膠條的雙向凝膠電泳及圖譜分析第1向等電聚焦電泳程序條件設(shè)定如下：50 V主動水化16 h；250 V除鹽1 h；1 000 V除鹽1 h，當升壓至10 000 V后再繼續(xù)聚焦直至60 000 V完成聚焦程序；第2向聚丙烯酰胺凝膠電泳條件如下：分離電流（30 mA/gel/17 cm）。Gs-800掃描獲取圖像后PDQuest7.1軟件進行分析。

1.4 膠內(nèi)酶解及MALDI-TOF-MS鑒定將掃描分析后的凝膠置于亮光下，用硅烷化的槍頭挖取差異蛋白點，將獲取的樣品交由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司以協(xié)助完成基質(zhì)輔助電離解析飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）蛋白鑒定，得到各個檢測樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜。

1.5 數(shù)據(jù)庫檢索根據(jù)肽質(zhì)量指紋圖譜中各肽段的m/z數(shù)據(jù)，在蛋白質(zhì)組的相關(guān)網(wǎng)站（http：//www.matrixscience.com），利用Mascot查詢軟件，設(shè)置出適當?shù)乃阉鲄?shù)，在蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索與酶解肽段相匹配的蛋白，根據(jù)搜索結(jié)果并結(jié)合蛋白質(zhì)在凝膠上的實際等電點和相對分子質(zhì)量信息最終確定蛋白質(zhì)性質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌患者血清和正常人血清的雙向電泳圖譜的建立經(jīng)過多次雙向電泳，獲得重復(fù)性較好的肺腺癌及正常血清雙向凝膠電泳的蛋白質(zhì)圖譜（圖1），平均蛋白點個數(shù)為295±15、301±12?？梢姶蟛糠值鞍踪|(zhì)點分布的范圍在相對分子質(zhì)量為31 000～56 000、等電點在5.0～8.0之間，同時可見血清中一些高豐度蛋白在膠面上連接成片。

圖1 肺腺癌患者（A）和正常人（B）血清雙向凝膠電泳圖譜

2.2 肺腺癌患者血清和正常人血清的雙向電泳圖譜中差異蛋白質(zhì)點分析對肺腺癌血清和正常血清的雙向電泳圖譜分別進行匹配分析后，共篩查出24個存在差異的蛋白點，其中Spot 1～8在肺腺癌血清中高表達，而Spot 9～12號僅出現(xiàn)在肺腺癌患者的血清中；Spot 13～22號蛋白點在肺腺癌患者血清中低表達，Spot 23，24號蛋白點僅出現(xiàn)在正常人的血清中。部分蛋白質(zhì)點的放大圖譜見圖2。

2.3 差異蛋白點的MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖及蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果從分析出來的24個差異蛋白中選出表達差異較大的7個蛋白點，其中4個蛋白點（Spot 2，3，8，9）在肺腺癌血清中高表達，3個蛋白點（Spot 16，17，19）在肺腺癌血清中低表達，經(jīng)MALDITOF-MS鑒定后，均獲得相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖譜（圖3）。將其中有代表性的特征數(shù)據(jù)在蛋白數(shù)據(jù)庫應(yīng)用Mascot軟件搜索并分析，最終5個（Spot 2，3，9，17，19）在數(shù)據(jù)庫中找到匹配的蛋白質(zhì)（Score＞64，P＜0.05），分別是在肺腺癌血清中高表達的凝聚素、觸珠蛋白、血清淀粉樣蛋白A和肺腺癌血清中低表達的血清白蛋白A鏈、纖維膠凝蛋白3。

圖2 肺腺癌患者（A）和正常人（B）血清部分蛋白質(zhì)點放大圖譜

圖3 Spot 9蛋白點的肽質(zhì)量指紋圖

3 討論

血清蛋白質(zhì)樣品的制備與細胞、組織樣品的制備稍有不同，血清樣品成分十分復(fù)雜［3］，除了含有大量的蛋白質(zhì)外，還含有較多的小分子物質(zhì)，如鹽類、氨基酸、脂類和糖類等。如果不加以剔除，將嚴重影響對大多數(shù)的低豐度蛋白的檢測。本實驗采用 SwellGel?Blue白蛋白去除試劑盒過濾血清，去除了大部分混雜的白蛋白，因此建立了肺腺癌患者血清和正常人血清的雙向電泳圖譜的表達圖譜，并篩查出24個差異的蛋白點，從中選出7個蛋白點進行MALDI-TOF-MS鑒定，最終5個蛋白點得到滿意的匹配結(jié)果，其中凝聚素、觸珠蛋白、血清淀粉樣蛋白A在肺腺癌血清中高表達，而纖維膠凝蛋白3和血清白蛋白A鏈則低表達。

凝聚素的是一種黏附蛋白，調(diào)節(jié)細胞與細胞的相互作用，參與脂類轉(zhuǎn)運，在人體的許多組織中均有表達，有研究［4］表明其在腫瘤組織中的表達高于癌旁組織。

觸珠蛋白的主要功能是與游離血紅蛋白結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物，被單核細胞以及巨噬細胞表面的血紅蛋白受體（CD163）所識別并被吞噬降解，從而除去血循環(huán)游離的血紅蛋白。觸珠蛋白也可能是一種急性期的時相反應(yīng)蛋白，當機體處于腫瘤、心肌梗塞等一些病理狀態(tài)時候，血液內(nèi)的結(jié)合珠蛋白含量明顯增多［5］。

另本研究結(jié)果提示血清淀粉樣蛋白A僅在肺腺癌血清中表達。血清淀粉樣蛋白是一組多形性蛋白，由104個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為 12 000～14 000［6］，主要由肝細胞合成并分泌至血。血清淀粉樣蛋白A是一種急性時相蛋白，正常情況下血清中含量很低僅為1～5 μg·mL-1，但在炎癥、外傷、腫瘤等刺激下，由于單核-巨噬細胞和內(nèi)皮細胞合成并釋放大量的炎性細胞因子，因此誘導(dǎo)肝細胞產(chǎn)生大量的急性期蛋白血清淀粉樣蛋白A，其含量可超過正常值的1 000倍［7］。Milan等［8］的研究發(fā)現(xiàn)血清淀粉樣蛋白在肺癌患者的血清中高表達。本研究也發(fā)現(xiàn)血清淀粉樣蛋白A肺腺癌患者的血清中高表達。

纖維膠凝蛋白3是激活補體系統(tǒng)的一種識別分子，對維持機體正常免疫功能起重要作用，因此在正常人的血清中含量較高［9］。本研究結(jié)果顯示纖維膠凝蛋白3在肺腺癌血清中的含量下調(diào)，提示在肺癌發(fā)展過程中，可能伴隨著免疫功能的逐漸減弱。

由于血清標本比組織標本容易獲得，所以從血清中篩選出的腫瘤標志物指標更合適應(yīng)用于診斷和判斷預(yù)后。本次研究結(jié)果中高表達的血清淀粉樣蛋白A、凝聚素和觸珠蛋白和低表達的纖維膠凝蛋白3，有可能成為有價值的肺癌診斷標志物。

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Screening and Identification of Serum Tumor Markers in Lung Adenocarcinoma

Yang Jiyao1，Liu Guohong1，Liu Deyi2，Ding Yi1，Wang Jing2
（1.Department of Histology and Embryology，College of Basic Medicine，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China；2.Department of Respiratory Medicine，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

ObjectiveTo screen the tumor markers in serum of patients with lung adenocarcinoma by proteome method.MethodsSerum samples were obtained from 8 patients lung adenocarcinoma and 8 healthy donors.After getting rid of various serum albumin，all the soluable proteins in serum were separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，then the differentially expressed proteins were identified by using PDQuest software analysis.Peptide mass fingerprint maps were obtained by matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry and protein identification was performed by searching protein database.ResultsPerfect reproducible two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis image were successfully obtained.Twenty-four differentially expressed proteins were found in serum between patients with lung adenocarcinoma and healthy donors.Peptide mass fingerprinting maps of 7 proteins were obtained and 5 proteins were identified eventually，including clusterin，haptoglobin 2-alpha，amyloid related serum protein，serum albumin chain A，ficolin-3.ConclusionThe two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis maps of serum from patients with lung adenocarcinoma and healthy donor were constructed，several proteins identified in this research may be the potential serum biomarkers for lung cancer.

lung adenocarcinoma；serum；two-dimensional gel electrophoresis；matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry；proteome

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.05.002

R734.2；R730.43

A

1673-5412（2014）05-0374-04

2014-03-05）

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計劃項目（編號：200903005）

楊繼要（1971-），女，博士，副教授，主要從事腫瘤分子生物學(xué)研究。F-mail：yangjiyao123@163.com

王靜（1958-），女，博士，教授，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)研究和臨床治療工作。F-mail：wangjing@zzu.edu.cn