陳麗萍，徐茂琴，何紅萍，李 曄,*

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 寧波 315100）

隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快，由食源性致病菌導(dǎo)致的食品安全問(wèn)題不斷出現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，全球每年發(fā)生40～60億例食源性疾病[1]。細(xì)菌污染是影響食品質(zhì)量和安全的主要因素，由其引起的食源性疾病的暴發(fā)嚴(yán)重?fù)p害人體健康。隨著現(xiàn)代食品安全控制技術(shù)如危害分析關(guān)鍵控制點(diǎn)（hazard analysis critical control point，HACCP）、微生物危險(xiǎn)性評(píng)估（microbio 1ogical risk assessment，MRA）的發(fā)展等，建立和完善一套微生物快速定量檢測(cè)技術(shù)，顯得尤為重要[2]。

目前常用的細(xì) 菌檢測(cè)方法大致包括目前常用的細(xì)菌檢測(cè)方法大致包括分離培養(yǎng)鑒定法、生化鑒定法、免疫學(xué)方法、DNA雜交和定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，QPCR）等方法[3-4]。傳統(tǒng)的細(xì)菌檢驗(yàn)方法靈敏度高、費(fèi)用低，但檢測(cè)所需時(shí)間較長(zhǎng)且工作量龐大。現(xiàn)代免疫學(xué)和分子生物學(xué)特異性好效率高，但一般樣品預(yù)處理過(guò)程比較復(fù)雜，且較難達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)的目的[5]。

PEN3型便攜式電子鼻傳感器是一種新穎的分析、識(shí)別和檢測(cè)手段。其根據(jù)對(duì)不同樣品的氣味信息進(jìn)行簡(jiǎn)單的比對(duì)分析，通過(guò)采集標(biāo)樣信息建立數(shù)據(jù)庫(kù)，再利用化學(xué)計(jì)量學(xué)的統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)未知樣品進(jìn)行定性和定量分析，具有快 速、便捷的特點(diǎn)，其工作原理類似人的鼻子，也稱之為“電子鼻”[6]。應(yīng)用電子鼻檢測(cè)，樣品處理方便，操作簡(jiǎn)單快捷、有望實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)。鄧高燕等[7]利用電子鼻技術(shù)對(duì)兩種細(xì)菌在菌株水平上揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，表明利用電子鼻進(jìn)行區(qū) 分和鑒定具有一定的可行性。胥勛濤等[8]利用自己開(kāi)發(fā)的氣味濃縮電子鼻提高了兩株病原菌的區(qū)分能力，表明電子鼻技術(shù)在微生物快速檢測(cè)上具有應(yīng)用潛力。喻勇新等[9]利用電子鼻技術(shù)檢測(cè)普通過(guò) 夜培養(yǎng)后的3 種細(xì)菌培養(yǎng)液，Concina等[10]將其應(yīng)用到加工番茄中的微生物污染檢測(cè)。目前化學(xué)傳感器的在食品中的應(yīng)用主要集中在果蔬成熟度和貯藏期的檢驗(yàn)[11-12]、奶制品的摻假檢驗(yàn)[13-14]、油脂的檢測(cè)[15-16]、以及谷物的貯藏檢驗(yàn)等[17]。

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌（Escherich coli）、糞鏈球菌（Fecal streptococcus）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是4 種常見(jiàn)的食源性致病菌。從生物分類學(xué)角度上看，這4 種致病菌歸于4 種不同的屬，依次分別為葡萄球菌屬、腸桿菌屬、鏈球菌屬和李斯特菌屬，4 者在基因序列以及代謝表型上均有差別，不同菌株對(duì)培養(yǎng)液的利用也存在差異性，從而其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物也必然是不同的[18]。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)PEN3型電子鼻傳感器對(duì)不同食源性致病菌代謝揮發(fā)物質(zhì)的差異響應(yīng)，研究應(yīng)用PEN3型電子鼻傳感器快速檢測(cè)區(qū)分不同食源性致病菌的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）ATCC 29213、大腸桿菌（Escherich coli）ATCC 25922、糞鏈球菌（Streptococcus fecal）ATCC 29212、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19111 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

LB液體培養(yǎng)基：5 g/L酵母提取物、10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L氯化鈉，培養(yǎng)基配制好后經(jīng)過(guò)121 ℃高壓濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3型便攜式電子鼻傳感器 德國(guó)Airsense公司；QYC-200型恒溫?fù)u床 上海比朗儀器有限公司；BYY-300型培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；732N可見(jiàn)分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1F單人雙面超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品菌液的制備

將各菌種活化后分別挑取單菌落，接種于裝有100 mL LB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，置于37 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜作為原始菌液，菌落數(shù)約為108CFU/mL，保存?zhèn)溆谩?/p>

采用梯度稀釋法，用無(wú)菌培養(yǎng)液分別將原始菌液稀釋103、105倍和107倍得到樣品菌液（對(duì)應(yīng)菌落數(shù)分別為105、103CFU/mL和10 CFU/mL），各取0.5 mL分裝到10 mL的傳感器樣品瓶中，進(jìn)行傳感器檢測(cè)。

吸取1 mL原始菌液加入25 mL培養(yǎng)液中，于37 ℃，120 r/min恒溫?fù)u床上培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10 h準(zhǔn)確吸取0.5 mL培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行PEN3型電子鼻傳感器檢測(cè)。

1.3.2 電子鼻傳感器原理及檢測(cè)

PEN3型電子鼻傳感器是由10 種金屬氧化物半導(dǎo)體型（metal oxide semiconductor，MOS）化學(xué)傳感元件組成，每型傳感元件所對(duì)應(yīng)的主要敏感物質(zhì)類型有一定的區(qū)別（表1）。PEN3主要通過(guò)運(yùn)行一個(gè)改進(jìn)過(guò)的解吸單元，具有自動(dòng)調(diào)整、自動(dòng)校準(zhǔn)及系統(tǒng)自動(dòng)富集的功能，其主要原理是利用傳感器和氣體相互作用，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而使傳感器活性材料的導(dǎo)電性發(fā)生變化，以電路中電阻的變化值進(jìn)行信號(hào)輸出[6]。傳感器的響應(yīng)信號(hào)即為傳感器接觸到樣品揮發(fā)性物質(zhì)后的電導(dǎo)率G與傳感器在經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)活性炭過(guò)濾氣體后的電導(dǎo)率G0的比值。不同菌液在不同條件下有不同的代謝產(chǎn)物，在傳感器上呈現(xiàn)不同的氣味感應(yīng)信號(hào)。

表 1 化學(xué)傳感器及其對(duì)應(yīng)的敏感物質(zhì)類型Table 1 Chemical sensors corresponding to different types of volatile substances

準(zhǔn)確吸取樣品菌液0.5 mL于樣品瓶中，25 ℃恒溫環(huán)境中運(yùn)用PEN3型便攜式電子鼻傳感器對(duì)樣品菌液進(jìn)行檢測(cè)。傳感器信號(hào)在90 s后基本穩(wěn)定，選定信號(hào)采集時(shí)間為100 s。每組樣品菌液分別做3 次平行重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

選取化學(xué)傳感器檢測(cè)第100秒的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用R For Windows對(duì)傳感器的響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行傳感器響應(yīng)聚類分析，PEN3型傳感器配套的 Winmuster軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）及線性判別分析（ linear discriminant analysis，LAD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳感器的信號(hào)響應(yīng)

PEN3型電子鼻傳感器中10 種金屬 氧化物半導(dǎo)體型化學(xué)傳感元件對(duì)不同細(xì)菌樣品的檢測(cè)反應(yīng)可得到響應(yīng)曲線和雷達(dá)圖（圖1）。從檢測(cè)樣品的傳感器響應(yīng)曲線中可以得到各個(gè)菌株樣品傳感器信號(hào)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)。各菌株不同培養(yǎng)時(shí)間，不同濃度的揮 發(fā)性物質(zhì)各不相同，故10 種化學(xué)傳感元件對(duì)不同氣味有不同的響應(yīng)，信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱可通過(guò)雷達(dá)圖形狀的差異可反映出來(lái)。

圖 1 10 個(gè)傳感元件對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)2 h后樣品的響應(yīng)曲線（A）和 雷達(dá)圖（B）F ig.1 Response curves (A) and radar chart (B) of ten sensors for E. coli cultured for 2 h

2.2 傳感器響應(yīng)的聚類分析

圖 2 10 種傳感元件響應(yīng)值的聚類區(qū)分Fig.2 Cluster analysis of the response values from ten sensors

由圖2可知，化學(xué)傳感器的10 型傳感元件（M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10）對(duì)不同菌株的各自響應(yīng)之間存在明顯差異，表明不同樣本之間的揮發(fā)物質(zhì)存在較大差異。

根據(jù)響應(yīng) 值判斷，M4型傳感元件（主要對(duì)氫氣有選擇性）在不同菌株與培養(yǎng)基之間的響應(yīng)值較為接近，M2型傳感元件（靈敏度大，對(duì)氮氧化合物很靈敏）的各個(gè)響應(yīng)值之間區(qū)別較大。根據(jù)響應(yīng)值的不同，PEN3的10 種傳感器元件在金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌等4 種菌和空白培養(yǎng)基的響應(yīng)可聚為3 類：M2一類，M1、M7、M9一類，M3、M4、M5、M6、M8、M10這6個(gè)傳感器元件為一類。說(shuō)明不同傳感 元件對(duì)菌株 和培養(yǎng)基的代謝產(chǎn)物氣味之間存在一定程度的關(guān)聯(lián)度。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌和空白培養(yǎng)基在不同傳感器元件上的響應(yīng)值存在差異，根據(jù)響應(yīng)值可聚為3 類：?jiǎn)卧隼钏固鼐痛竽c桿菌聚一類，空白培養(yǎng)基一類，糞鏈球菌和金黃色葡萄球菌為一類。表明細(xì)菌與培養(yǎng)基之間的區(qū)別可用傳感器表征，但是不同菌株之間存在一定的聚類性，需要進(jìn)一步進(jìn)行區(qū)別驗(yàn)證。

2.3 不同菌株穩(wěn)定時(shí)期的響應(yīng)區(qū)分

圖 3 不同細(xì)菌穩(wěn)定期時(shí)的PCA分析（A）和LDA分析（B）Fig.3 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of different bacteria at the stationary growth stage

PCA是將提取的傳感器響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維，并對(duì)降維后的特征向量進(jìn)行線性分類，PC1和PC2上包含了在PCA轉(zhuǎn)換中得到的第1主成分和第2成分的方差貢獻(xiàn)率。方差貢獻(xiàn)率越大，說(shuō)明此主要成分可以較好的反映原來(lái)多指標(biāo)的信息。一般情況下，總貢獻(xiàn)率超過(guò)70%～85%的方法即可使用[14]。LDA將樣品信號(hào)數(shù)據(jù)通過(guò)運(yùn)算法則投影到某一方向，注重樣品在空間中的分布狀態(tài)及彼此間的距離分析，可以使組間變異與組內(nèi)變異的比率最大。

基于Winmuster軟件將傳感器采集到的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌4株菌信號(hào)采用PCA和LDA法建立細(xì) 菌穩(wěn)定期時(shí)的響應(yīng)模型，如圖3所示。大腸桿菌、糞鏈球菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌4 株樣本的分析數(shù)據(jù)點(diǎn)均分布于各自區(qū)域，沒(méi)有重疊， 并且它們之間的距離較大。PC1、PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為86.66%和10.79%，PC1、PC2的總貢獻(xiàn)率為97.45%，LD1、LD2的方差貢獻(xiàn)率分別為62.61%和29.64%，LD1、LD2的總貢獻(xiàn)率為92.25%，這說(shuō)明這4 株細(xì)菌與空白培養(yǎng)基之間的揮發(fā)性氣味有較大差異，PEN3型電子鼻傳感器能夠準(zhǔn)確地識(shí)別出不同細(xì)菌的特征氣味，采用PCA和LDA方法能對(duì)其進(jìn)行較好的區(qū)分。

2.4 不同培養(yǎng)時(shí)間下菌株的傳感器響應(yīng)

表 2 不同培養(yǎng)時(shí)間4 種菌株P(guān)CA和LDA分析的方差貢獻(xiàn)率Table 2 Variance contribution of four bacteria cultured for different times by PCA analysis and LDA analysis

圖 4 不同 培養(yǎng)時(shí)間金黃色葡萄球菌的PCA區(qū)分（A）和LDA區(qū)分（B）Fig.4 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Staphylococcus aureus at different culture times

圖 5 不同培養(yǎng)時(shí)間下大腸桿菌的PCA區(qū)分（A）和LDA區(qū)分（B）Fig.5 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of E. coli at different culture times

圖 6 不同培養(yǎng)時(shí)間糞鏈球菌的PCA區(qū)分（A）和LDA區(qū)分（B）Fig.6 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Streptococcus fecal at different culture times

圖 7 不同培養(yǎng)時(shí)間下單增李斯特菌的PCA區(qū)分（A）和LDA區(qū)分（B）Fig.7 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Listeria monocytogenes at different culture times

將接種搖床培養(yǎng)2、4、6、8、10 h后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌進(jìn)行PCA和LDA分析，如圖4～7所示，各菌株的方差貢獻(xiàn)率如表2所示。不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌的數(shù)據(jù)點(diǎn)的方差總貢獻(xiàn)率均大于85%。在PCA和LDA區(qū)分度下，經(jīng)過(guò)不同培養(yǎng)時(shí)間的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌各自位于一定的區(qū)域范圍，不同菌株區(qū)分度明顯，沒(méi)有出現(xiàn)重疊且貢獻(xiàn)率較高。

不同種類的細(xì)菌菌體所含的酶系統(tǒng)不同，其分解能力不同，從而其代謝產(chǎn)物不同。同時(shí)，由于細(xì)菌生長(zhǎng)要經(jīng)歷遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期4 個(gè)階段，所以對(duì)同一細(xì)菌的不同生長(zhǎng)階段，揮發(fā)物的濃度也有差異[5]。也就是說(shuō)在同樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間后，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的利用情況和所產(chǎn)生的產(chǎn)物就會(huì)不同。檢測(cè)表明使用PEN3型電子鼻傳感器可以根據(jù)氣體成分的差異而將不同時(shí)期的細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分。

2.5 傳 感器對(duì)不同濃度細(xì)菌的響應(yīng)區(qū)分

圖 8 不同稀釋濃度金黃色葡萄球菌的PCA（A）和LDA（B）區(qū)分Fig.8 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Staphylococcus aureus at different concentrations

圖 9 不同稀釋濃度大腸桿菌的PCA（A）和LDA（B）區(qū)分Fig.9 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of E. coli at different concentrations

圖 10 不同稀釋濃度糞鏈球菌的PCA（A）和LDA（B）區(qū)分Fig.10 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Streptococcus fecal at different concentrations

圖 11 不同稀釋濃度單增李斯特菌的PCA（A）和LDA（B）區(qū)分Fig.11 PCA analysis (A) and LDA analysis (B) of Listeria monocytogenes at different concentrations

將處于生長(zhǎng)穩(wěn)定期的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌4 種菌的原始菌液分別稀釋103、105、107倍（對(duì)應(yīng)菌落數(shù)為105、103、10 CFU/mL）后進(jìn)行PEN3型電子鼻傳感器檢測(cè)，并進(jìn)行PCA和LDA分析，結(jié)果如圖8～11所示。在所建的模型中，不同濃度的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌各自分析數(shù)據(jù)點(diǎn)均分布于各自區(qū)域，沒(méi)有重疊。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、李斯特菌4 種菌的各自不同濃度的菌液在PCA圖上都能夠很好的區(qū)分開(kāi)，區(qū)分度較為集中，主要在PC1和LD1上，這表明傳感器對(duì)細(xì)菌的響應(yīng)較為靈敏，主成分分析和線性判別分析的區(qū)分度較強(qiáng)。根據(jù)穩(wěn)定時(shí)期不同濃度細(xì)菌產(chǎn)生的代謝揮發(fā)性物質(zhì)的濃度不同，基于PEN3型電子鼻傳感器的靈敏性，在建立不同細(xì)菌的指紋圖譜基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步研究了其對(duì)低濃度細(xì)菌的識(shí)別能力。

3 結(jié) 論

基于金屬氧化物的PEN3型電子鼻傳感器技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞鏈球菌、單增李斯特菌4 種食源性致病菌培養(yǎng)液的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，PCA、LDA均可建立4種菌的指紋圖譜，并將4 種致病菌株明顯區(qū)分開(kāi)，在原始菌液稀釋107倍后（對(duì)應(yīng)菌落數(shù)約10 CFU/mL）的較低濃度下仍能區(qū)分開(kāi)。這說(shuō)明基于氣味指紋的PEN3型電子鼻傳感器技術(shù)具有區(qū)分不同微生物的潛在能力，有望在致病菌快 速檢測(cè)和鑒定方面進(jìn)一步得到應(yīng)用。但具體的特征性揮發(fā)性成分組成可進(jìn)一步結(jié)合儀器如GC-MS、GC-O等進(jìn)行檢測(cè)[19-22]。

相對(duì)于傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法[23-25]，PEN3型電子鼻傳感器檢測(cè)主要針對(duì)于微生物的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，對(duì)樣品沒(méi)有特殊的要求，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)時(shí)短靈敏度高，最重要的是在操作過(guò)程中不需要對(duì)樣品進(jìn)行任何破壞處理，這在微生物快速檢測(cè)中是一項(xiàng)非常有發(fā)展前景的無(wú)損傷快速檢測(cè)方法，有望在食源性致病菌的低濃度快速檢測(cè)和鑒定方面進(jìn)一步得到利用。

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