簡(jiǎn)江琰，余國(guó)麗

(資中縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川資中641200)

·論著·

不明原因性流產(chǎn)患者蛻膜組織液中Galectin-1變化初步研究

簡(jiǎn)江琰，余國(guó)麗

(資中縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川資中641200)

目的 通過(guò)檢測(cè)半乳糖凝集素-1(Galectin-1)在不明原因性流產(chǎn)(UHA)患者蛻膜組織液中的表達(dá)及變化，探討Galectin-1蛋白對(duì)胎盤(pán)形成的影響。方法選取2010年6月至2011年12月我科收治的流產(chǎn)患者40例以及正常非孕婦女志愿者20例為研究對(duì)象，其中以非孕婦女志愿者20例為A組，20例自愿要求人工流產(chǎn)的正常早孕婦女為B組，20例不明原因性流產(chǎn)患者為C組，分析三組受試對(duì)象的年齡、孕周、蛻膜組織液中Galectin-1蛋白表達(dá)、外周血中CD4+%、CD4+CD25+%、CD4+CD25+Foxp3+%變化。結(jié)果①B組與C組蛻膜組織液中Galectin-1表達(dá)均明顯高于A組，B組Galectin-1表達(dá)明顯高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；②C組外周血中CD4+CD25+Foxp3+%顯著低于B組(P＜0.05)，且CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比值低于A組和B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論UHA患者蛻膜組織中Galectin-1表達(dá)下降，且外周血CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比值下降，兩者均不利于胚胎發(fā)育，早期介入調(diào)節(jié)兩者的異常表達(dá)有望成為治療UHA的新途徑，值得引起關(guān)注。

不明原因性流產(chǎn)；半乳糖凝聚素-1；蛻膜組織；免疫學(xué)機(jī)制

自然流產(chǎn)2次或2次以上即定為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因較為復(fù)雜，排除遺傳、內(nèi)分泌紊亂、解剖異常、感染等因素之后，仍然有40%～80%的發(fā)病原因不明，臨床上常將其稱為不明原因性流產(chǎn)(Unexplained habitual abortion，UHA)[1]。UHA的臨床處理較為棘手，隨著免疫學(xué)的發(fā)展，近些年臨床相關(guān)研究更多注重于免疫學(xué)因素所致的自然流產(chǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)半乳糖凝聚素-1(Galectin-1)通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡、識(shí)別糖復(fù)合物等機(jī)制參與肺泡植入和維持整個(gè)妊娠過(guò)程，為胚胎的生長(zhǎng)提供免疫抑制的環(huán)境[2]。本文通過(guò)檢測(cè)正常非孕子宮內(nèi)膜、UHA患者與正常早孕婦女的蛻膜組織液中Galectin-1的表達(dá)及變化，分析探討妊娠年齡、孕周、蛻膜組織液中Galectin-1表達(dá)、外周血中CD4+%、CD4+CD25+%、CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比例是否與流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)，以此探索UHA的發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料40例流產(chǎn)患者均來(lái)自我院生殖免疫科室，年齡22～38歲。A組為同期于本院宮腔鏡檢查子宮內(nèi)膜并自愿參與本次調(diào)查的20例健康非孕婦女，既往無(wú)流產(chǎn)史，剔除遺傳、內(nèi)分泌異常、自身免疫性疾病及其他疾病。B組為同期因非意愿妊娠要求人工流產(chǎn)的20例正常早孕婦女，經(jīng)檢查排除內(nèi)分泌、生殖系統(tǒng)解剖、感染及自身免疫性疾病史，且無(wú)先兆流產(chǎn)癥狀，經(jīng)B超檢查胚胎發(fā)育正常。C組為2011年6～12月期間就診的20例UHA患者，均符合臨床診斷。

1.2 樣本采集及預(yù)處理采集標(biāo)本所用的工具均要求相對(duì)無(wú)菌操作，A組的子宮內(nèi)膜組織、B組和C組的蛻膜組織在離體20 min內(nèi)用PBS沖洗，用4%多聚甲醛溶液固定，24 h后石蠟包埋，切片4 μm以備免疫組化染色用。

1.3 Galectin-1蛋白表達(dá)的檢測(cè)上述組織切片經(jīng)脫蠟、消化、微波抗原修復(fù)、封閉、加入一抗、二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察，以PBS代替一抗作空白對(duì)照，待檢切片陽(yáng)性結(jié)果為棕黃色。采用免疫組化染色法檢測(cè)樣本中Galectin-1蛋白，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 外周血中各亞細(xì)胞群相對(duì)含量的檢測(cè)采集各組受檢對(duì)象空腹肘中靜脈血5 ml，0.1 ml肝素抗凝，標(biāo)本采集后4 h內(nèi)采用“三標(biāo)記染色法”完成測(cè)定項(xiàng)目。采用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，PBS液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/ml，2只潔凈的流式管分別加入100 L細(xì)胞懸液，其中一管加入CD4-FITC抗體20 ml、CD25-APC抗體20 ml和20 ml抗人Foxp3-PE，混勻，另一管作為對(duì)照不加任何試劑，4℃避光孵育30 min，兩管3 000 r/min離心5 min，棄去上清，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果以熒光抗體染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率記錄表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

A組、B組和C組受試對(duì)象的平均年齡分別為(28.85±3.048)歲、(29.30±3.213)歲和(28.10±3.553)歲，其組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；B、C兩組患者的平均孕期分別為(53.25±8.996)d和(59.95± 12.416)d，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；B組和C組患者蛻膜組織液中Galectin-1表達(dá)水平明顯高于A組(P＜0.05)，而B(niǎo)組患者Galectin-1表達(dá)水平明顯高于C組(P＜0.05)。此外，C組患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+%明顯低于B組(P＜0.05)，且CD4+CD25+Foxp3+/ CD4+顯著低于A組和B兩組(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 三組婦女的各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s)

表1 三組婦女的各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s)

注：B組與A組比較，aP＜0.05；C組與B組比較，bP＜0.05；C組與A組比較，cP＜0.05。

3 討論

3.1 UHA發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制妊娠是一種同種移植現(xiàn)象，胚胎作為同種移植物在母體內(nèi)存活直到分娩出母體，實(shí)際上正好反映了母體對(duì)胚胎的免疫耐受，UHA的發(fā)生與母胎免疫耐受失衡有關(guān)。胚胎著床及發(fā)育過(guò)程需要眾多因素的共同參與，包括粘附分子、細(xì)胞因子等，任何一個(gè)因素的改變均可導(dǎo)致妊娠結(jié)局發(fā)生變化。早孕婦女體內(nèi)存在著復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，體現(xiàn)為免疫耐受中的抑制反應(yīng)增強(qiáng)，而免疫排斥功能相對(duì)減弱，維持這種微妙的平衡狀態(tài)可保護(hù)胚泡的正常著床及胚胎的正常發(fā)育。T細(xì)胞在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)節(jié)作用，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)是具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，其表達(dá)頻率下降與UHA發(fā)病有關(guān)[3]。Treg細(xì)胞可抑制T細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞因子，防止機(jī)體發(fā)生自身免疫反應(yīng)，F(xiàn)oxp3是CD4+CD25+Treg發(fā)育和維持功能的重要調(diào)節(jié)基因，外周血Foxp3表達(dá)降調(diào)可能參與自然流產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)中C組UHA患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+%顯著低于B組，且CD4+CD25+Foxp3+/CD4+比值低于A組、B組，也說(shuō)明Foxp3的下降與不明原因流產(chǎn)有關(guān)。Th1/Th2細(xì)胞因子是CD4+T細(xì)胞分泌的兩個(gè)不同細(xì)胞因子亞群，兩者互相抑制，Th1細(xì)胞因子主導(dǎo)細(xì)胞免疫，對(duì)胚胎有免疫損傷作用，Th2主導(dǎo)體液免疫，對(duì)妊娠其免疫保護(hù)作用。自身免疫性疾病的發(fā)生Th1/Th2細(xì)胞相對(duì)失衡狀態(tài)有關(guān)，母體蛻膜細(xì)胞的凋亡與增殖不斷地進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)改建，是為了適應(yīng)胎兒的需要。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，正常妊娠小鼠從孕早期開(kāi)始，蛻膜細(xì)胞及子宮腺體上皮細(xì)胞即有少量凋亡細(xì)胞，其對(duì)維持正常妊娠有一定作用[4]。

3.2 Galectin-1基因與UHA的關(guān)系Galectin-1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的半乳凝素家族成員，具有高度保守的氨基酸基序編碼的糖結(jié)構(gòu)識(shí)別區(qū)域(Carbohydrate recognition domains，CRD)，已知其與腫瘤的生長(zhǎng)、粘附及轉(zhuǎn)移有關(guān)，在細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過(guò)程中舉足輕重。Galectin-1參與T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，通過(guò)一系列機(jī)制與受體結(jié)合并啟動(dòng)多種信號(hào)的傳導(dǎo)過(guò)程，抑制Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生，延緩炎性反應(yīng)效應(yīng)?？鬃暇傅萚5]研究提出，Galectin-1在小鼠沛泡植入時(shí)著床點(diǎn)子宮內(nèi)膜表達(dá)增高。Galectin-1 mRNA和蛋白正常早孕絨毛組織及蛻膜組織中的表達(dá)隨著孕周的增加而升高，Galectin-1在滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)和胎盤(pán)形成中可能起著重要作用[6]。Galectin-1在大多數(shù)免疫赦免組織中表達(dá)，包括胎盤(pán)、視網(wǎng)膜等組織，使這些組織具有抑制炎癥并保護(hù)自身完整的功能。胚胎的正常生長(zhǎng)有賴于一個(gè)合適的免疫抑制環(huán)境，通過(guò)早期干預(yù)Galectin-1的表達(dá)控制可處理免疫抑制異常所導(dǎo)致的不明原因性流產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，B組自愿流產(chǎn)婦女與C組UHA患者蛻膜組織液中Galectin-1表達(dá)均明顯高于A組，說(shuō)明Galectin-1的表達(dá)與妊娠有關(guān)，此外，B組Galectin-1表達(dá)明顯高于C組，也表明Galectin-1的表達(dá)不足參與不正常妊娠，也提示Galectin-1在妊娠過(guò)程中的重要性。

3.3 展望目前UHA的免疫性治療是建立在免疫學(xué)假說(shuō)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的經(jīng)驗(yàn)性治療，通過(guò)各種藥物來(lái)作用于免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制中的環(huán)節(jié)，使免疫反應(yīng)朝著有利于妊娠維持的方向發(fā)展，臨床已有采用主動(dòng)免疫治療方法[7]、淋巴療法[8]等來(lái)治療UHA，但效果仍有待臨床大規(guī)模實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。對(duì)正常早孕及UHA患者蛻膜組織液分析發(fā)現(xiàn)，Galectin-1在早孕過(guò)程中的降表達(dá)是引起流產(chǎn)發(fā)生的重要因素，與此同時(shí)對(duì)UHA患者外周血中相關(guān)定量分析發(fā)現(xiàn)正常早孕與UHA患者的CD4+CD25+Foxp3+%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，UHA患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+有明顯降低，說(shuō)明母體免疫抑制的平衡狀態(tài)受到破壞，糾正這種失衡狀態(tài)即有可能治療UHA。本文尚屬初期研究，有待進(jìn)一步深入研究探討Galectin-1下調(diào)與CD4+CD25+Foxp3+的相關(guān)性，以探求為UHA提供實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)并探討治療途徑的可能性，同時(shí)為指導(dǎo)UHA患者妊娠及改善妊娠結(jié)局提供參考價(jià)值。

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Preliminary study on the change of Galectin-1 expression in deciduas tissue of patients with unexplained habitual abortion.

JIAN Jiang-yan,YU Guo-li.Department of Gynecology and Obstetrics,People's Hospital of Zizhong County,Neijiang 641200,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo detect expression and change of Galectin-1 in deciduas tissue of patients with unexplained habitual abortion(UHA),and to explore the affect of Galectin-1 protein on the formation of placenta.MethodsSurvey was conducted from June 2010 to December 2011 with 40 patients of abortion and 20 normal non-pregnant female volunteers,which were divided into group A(20 normal non-pregnant female volunteers),group B(20 patients voluntarily requesting for artificial abortion),group C(20 patients of UHA).The maternal age,gestational weeks,expression of Galectin-1 protein in deciduas tissue,changes of CD4+%,CD4+CD25+%,CD4+CD25+Foxp3+% in peripheral blood were analyzed.Results(1)Galectin-1 expression in group B and group C were significantly higher than group A(P＜0.05),which was also significantly higher in group B than group C(P＜0.05).(2)Peripheral blood CD4+CD25+Foxp3+%in group C was significantly lower than that in group B(P＜0.05),and CD4+CD25+Foxp3+/ CD4+ratios was significantly lower in group C than group A and group B(P＜0.05).ConclusionIn patients UHA, Galectin-1 expression in deciduas tissue decreases,and CD4+CD25+Foxp3+/CD4+ratio in peripheral blood declines,which are both not conducive to embryonic development.Early intervention to change the abnormal expression of Galectin-1 is expected to become a new way to treat UHA.

Unexplained habitual abortion(UHA);Galectin-1;Deciduas tissue;Immunological mechanisms

R714.21

A

1003—6350（2014）21—3177—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.21.1246

2014-04-21)

簡(jiǎn)江琰。E-mail：2877267859@qq.com