全琛宇，楊 磊，王 凱，王 瑞，李麗萍，梁萬文，甘 西，李 健，3＊，陳 明＊

（1.廣西水產(chǎn)研究所廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西南寧530021；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；3.廣西大學(xué)食品與質(zhì)量安全研究中心，廣西南寧530005）

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）又稱B群鏈球菌（group B streptococci，GBS），在自然界中廣泛分布，是一種重要的人獸共患病原菌［1-3］，也是一種重要的水產(chǎn)動物致病菌［4-5］。魚類無乳鏈球菌病的流行與暴發(fā)在許多國家均有報道［5-9］，給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，魚類無乳鏈球菌病在我國的發(fā)生率呈上升趨勢，特別是位于我國南部的廣東、廣西和海南等地暴發(fā)嚴(yán)重［10-11］。目前，對于羅非魚鏈球菌病的防治方法多樣，其中使用疫苗免疫是最重要的方法之一。因此，我國正大力發(fā)展羅非魚無乳鏈球菌病疫苗的研究，并取得一定進(jìn)展［12-13］。本試驗利用自行研制的無乳鏈球菌口服疫苗免疫羅非魚，應(yīng)用HE 染色方法觀察腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)、杯狀細(xì)胞以及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的分布和數(shù)量，探討該疫苗的免疫機(jī)制及不同免疫劑量的免疫效果，以期為該疫苗的深入研究和推廣應(yīng)用積累資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用羅非魚由廣西水產(chǎn)研究所國家級羅非魚良種場提供，體重為100 g±10 g，體長為15cm±2cm；無乳鏈球菌GX035弱毒苗由廣西水產(chǎn)研究所魚類病害防治實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 羅非魚飼養(yǎng)于室內(nèi)水箱中（規(guī)格：70cm×50cm×40cm），各組水質(zhì)均為脫氯自來水，全天供氧。試驗期間水溫保持在27 ℃～29 ℃，每周換水2／3。每天飼喂2 次（8：00 和16：00），日投飼率為2%～3%。

1.2.2 試驗分組與處理 選用體重為100g±10g，體長為15cm±2cm 的健康羅非魚共125尾，隨機(jī)分為5 個試驗組，每組25 尾魚。免疫前馴養(yǎng)2周。試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為免疫組，分別投喂劑量為1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU／mL的口服型無乳鏈球菌GX035 弱毒苗（每100g飼料用100 mL 相應(yīng)濃度的菌懸液拌勻后在50 ℃烘箱中烘干），試驗Ⅴ組為空白對照組，投喂未添加疫苗的飼料，按照2.5g／尾進(jìn)行投喂。

1.2.3 組織切片制備 免疫接種15d后，從各組中隨機(jī)抽取1尾（共5尾）羅非魚進(jìn)行解剖，迅速取出前腸、中腸和后腸分別制樣。前腸在胃后端至腸道的第一個彎曲之間取材，中腸在腸道的第一個彎曲至最后一個彎曲之間取材，后腸在腸道最后一個彎曲至肛門之間取材，各腸段長度約1cm。將腸段浸入pH7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液中沖洗腸道內(nèi)容物，使用Bouin固定液固定各腸段后，制作石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀察［15］。

1.2.4 各指標(biāo)的形態(tài)觀察和測量 參照黃玉章等［16］提供的方法，每段腸道選取5張染色效果較好的切片于400倍鏡下對以下指標(biāo)進(jìn)行觀察：腸絨毛、各腸段肌層厚度、杯狀細(xì)胞、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)（Superimage verson 6.0.1.2）對其進(jìn)行拍照和測量。

1.2.5 攻毒試驗 免疫20d后，所有魚（各組均為20尾）均按照1.67×107CFU／尾的劑量腹腔注射感染無乳鏈球菌，記錄攻毒后10d內(nèi)各組魚的死亡數(shù)，并計算相對免疫保護(hù)率（RPS）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 羅非魚腸絨毛長度的變化

各試驗組不同腸段的腸絨毛長度均呈現(xiàn)前腸最長，中腸次之，后腸最短的規(guī)律。免疫組與對照組不同腸段腸絨毛長度相比，差異均不顯著（P＞0.05）（表1）。

2.2 羅非魚腸道肌層厚度的變化

各試驗組不同腸段的肌層厚度均呈現(xiàn)前腸最薄，中腸次之，后腸最厚的規(guī)律。免疫組與對照組相比較，前腸肌層厚度：免疫Ⅰ組與對照組相比有增厚，但差異不顯著（P＞0.05），免疫Ⅱ組～Ⅳ組較對照組增加20.96%、20.09%、31.51%，差異極顯著（P＜0.01）；中腸肌層厚度：免疫Ⅰ組與對照組相比有縮短，但差異不顯著（P＞0.05），免疫Ⅱ組～Ⅳ組較對照組均有增加趨勢，其中免疫Ⅳ組較對照組增加17.01%，差異極顯著（P＜0.01）；后腸肌層厚度：各免疫組較對照組均增厚，其中免疫Ⅱ組增加10.95%，差異顯著（P＜0.05），免疫Ⅳ組增加19.41%，差異極顯著（P＜0.01）（表2）。

2.3 羅非魚腸道黏膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

腸黏膜層具有環(huán)形皺襞、腸絨毛和小腸腺，黏膜上皮由柱狀細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞等組成［15-16］。400倍鏡下觀察，各組腸段腸黏膜都較完整，層次分明。腸絨毛排列整齊，腸黏膜上皮細(xì)胞形狀規(guī)則，排列緊密，染色鮮明。各免疫組腸絨毛頂端稍有脫落，固有層中軸稍有增寬（圖1）。

2.4 對杯狀細(xì)胞分布及數(shù)量的影響

羅非魚腸道組織經(jīng)HE 染色后，顯微鏡下觀察杯狀細(xì)胞呈藍(lán)色或空泡狀。各腸段上皮均有杯狀細(xì)胞分布，散在分布于柱狀細(xì)胞之間，其頂部胞質(zhì)因大量糖原顆粒擁塞而膨脹，底部纖細(xì)，呈高腳杯狀。HE染色后，其頂部多糖成分因水解而呈現(xiàn)空泡狀（圖1）。免疫后各免疫組腸道內(nèi)，呈藍(lán)色的杯狀細(xì)胞數(shù)量均比對照組有所減少，差異極顯著（P＜0.01）（表3）。

表1 羅非魚腸絨毛長度的變化Table 1 Length changes of intertinal villi of tilapia μm

表2 羅非魚腸肌層厚度的變化Table 2 Mucular layer thickness changes of intertinal villi of tilapia μm

圖1 對照組和免疫組羅非魚腸絨毛形態(tài)圖（400×）Fig.1 The morphology intestinal villi of tilapia in control group and immunized groups（400×）

表3 羅非魚杯狀細(xì)胞數(shù)量變化Table 3 Quantity changes of goblet cells in intestine of tilapia

2.5 對上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞分布及數(shù)量的影響

對照組腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞多數(shù)位于上皮細(xì)胞基膜附近，少量見于上皮游離面，各免疫組腸道上皮淋巴細(xì)胞的分布則有所不同，上皮游離面的淋巴細(xì)胞增多，而且在固有層的分布亦增多，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象（圖1）。各免疫組前腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組相比較，差異均不顯著（P＞0.05）；免疫各組中腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組相比較均顯著增加，其中免疫Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組分別比對照組增加31.97%、31.51%、42.43%，差異極顯著（P＜0.01），免疫Ⅲ組增加19.66%，差異顯著（P＜0.05）；免疫各組后腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組相比較也均顯著增加，其中免疫Ⅰ組（1.0×106CFU／mL）、免疫Ⅱ組（1.0×107CFU／mL）和免疫Ⅳ組（1.0×109CFU／mL）分別比對照組增加34.82%、33.21%、38.32%，差異極顯著（P＜0.01），免疫Ⅲ組（1.0×108CFU／mL）比對照組增加27.09%，差異顯著（P＜0.05）（表4）。

2.6 攻毒后的保護(hù)效果

試驗Ⅰ～Ⅳ組的相對保護(hù)率分別為16.67%、27.78%、55.56%和66.67%，Ⅳ組相對保護(hù)率最高（表5）。

表4 羅非魚腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化Table 4 Quantity changes of intraepithelial lymphocytes of tilapia

表5 免疫保護(hù)試驗結(jié)果Table 5 The results of immune protection test

3 討論

腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是一群特殊的淋巴細(xì)胞，主要見于腸絨毛上皮細(xì)胞間，是機(jī)體免疫系統(tǒng)中與外來抗原以及微生物最先接觸的免疫細(xì)胞，參與腸道黏膜免疫反應(yīng)，處于免疫防御的第一線［16-17］。腸黏膜上皮與腸腔大量微生物、食物抗原接觸后，可通過調(diào)節(jié)腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞以預(yù)防腸腔致病微生物侵襲和對無害抗原產(chǎn)生耐受［24］。因此，腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化在一定程度上反映腸道局部黏膜免疫反應(yīng)狀況。黃春蘭等［18］研究表明，口服免疫ISCOMs疫苗一定時間后能夠刺激腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖，且不同腸段的變化規(guī)律不同；前、中腸變化趨勢相似，均表現(xiàn)為先下降后上升，其中免疫后14 d腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞與對照組相比總體呈下降趨勢，21d后數(shù)量開始上升，而后腸上皮淋巴細(xì)胞在免疫后7d小幅上升后持續(xù)降低，21d后達(dá)到試驗期間最低值。研究結(jié)果表明，免疫后15d，中、后腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞與對照組相比總體呈上升趨勢，且免疫Ⅳ組1.0×109CFU／mL 效果最明顯；而前腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量與對照組相比差異均不顯著。表明口服疫苗后，疫苗直接進(jìn)入腸道，可激活上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞。不同腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化規(guī)律不同，不同濃度的疫苗免疫后產(chǎn)生的效果不同，免疫后15d，免疫Ⅳ組1.0×109CFU／mL 上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量增殖最多，效果最明顯。不同腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化呈現(xiàn)不同規(guī)律，分析原因可能是前、中、后腸的生理結(jié)構(gòu)不同，從而免疫功能有所區(qū)別，但不同腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化的具體規(guī)律以及對魚體免疫功能的影響還需進(jìn)一步深入研究析。

黏液細(xì)胞是黏液分泌的生理基礎(chǔ)，它是魚類上皮中的一種腺體細(xì)胞，廣泛分布在皮膚、鰓、消化道等部位。這類細(xì)胞分泌的黏液除了具有機(jī)械性屏障、化學(xué)屏障，調(diào)節(jié)滲透壓、潤滑等作用外，黏液中含有的黏多糖、糖蛋白、免疫球蛋白及各種水解性酶類等非特異性的免疫活性物質(zhì)，可抵抗病原微生物入侵，從而保護(hù)魚體不受細(xì)菌、病毒等的侵害［18，20］。杯狀細(xì)胞是典型的黏液細(xì)胞，主要分布于消化道和呼吸道黏膜的上皮內(nèi)。正常情況下，底部狹窄形成長柄狀附著于基膜上，頂部充滿分泌顆粒而膨大，呈高腳杯狀，經(jīng)HE 染色后為藍(lán)色或空泡狀。杯狀細(xì)胞是腸道黏膜免疫應(yīng)答的重要成員，其數(shù)量及形態(tài)的變化在一定程度上反映腸道的局部免疫狀況。本試驗結(jié)果表明，各免疫組腸道內(nèi)，呈藍(lán)色的杯狀細(xì)胞數(shù)量均比對照組有所減少，差異極顯著（P＜0.01），但呈空泡狀的杯狀細(xì)胞明顯增多，且主要分布于腸絨毛底部或上部。表明經(jīng)口服免疫后，杯狀細(xì)胞呈現(xiàn)活躍的分泌狀態(tài)，無乳鏈球菌弱毒苗在一定程度上能增強(qiáng)腸道杯狀細(xì)胞的合成分泌功能。此外，良好的腸道黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)對保持魚類的健康及維持正常生產(chǎn)性能具有重要意義［21-22］。研究結(jié)果表明，各免疫組腸黏膜都較完整，但均發(fā)現(xiàn)腸絨毛頂端稍有脫落，固有層中軸稍有增寬的現(xiàn)象，表明弱毒苗免疫后，羅非魚相關(guān)免疫反應(yīng)被激活，腸道會發(fā)生輕微的炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)腸道組織結(jié)構(gòu)輕微損傷等現(xiàn)象。賴翔等［23］研究證明，飼糧添加蘇氨酸能在一定程度上減緩PRV 弱毒苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激帶來的斷奶仔豬生長性能下降和腸道損傷；一些研究證明［16，24-25］，黃芪多糖、低聚木糖、木聚糖酶等飼料添加劑可促進(jìn)魚的生長發(fā)育，促進(jìn)受損腸黏膜細(xì)胞的修復(fù)；因此在使用無乳鏈球菌弱毒苗免疫時，可在飼養(yǎng)過程中適當(dāng)配合使用飼料添加劑，以改善弱毒苗的不良影響。

組織學(xué)觀察表明，無乳鏈球菌口服弱毒疫苗可刺激腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞活化增殖，促進(jìn)腸道杯狀細(xì)胞的合成及分泌功能等，其中以免疫Ⅳ組1.0×109CFU／mL變化最為明顯；同時攻毒感染試驗結(jié)果顯示，免疫組的羅非魚因不同免疫劑量產(chǎn)生了不同程度的免疫保護(hù)，其中以免疫Ⅳ組1.0×109CFU／mL效果最為理想，相對保護(hù)率達(dá)到66.67%。試驗結(jié)果表明，該疫苗可通過激活腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞的免疫功能從而產(chǎn)生對機(jī)體的有效保護(hù)，其中以1.0×109CFU／mL 的疫苗濃度免疫保護(hù)效果最好。

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