林慶燕,陳書琨,孫 潔,唐金明,2,陳 兵,盧體康,劉建利,廖立珊,曾少靈,祁振強,阮周曦,呂建強,楊俊興,曹琛福,張彩虹,花群義,秦智鋒*
(1.深圳出入境檢驗檢疫局,廣東深圳518045;2.華南農(nóng)業(yè)大學,廣東廣州510642;3.深圳市寶舜泰生物醫(yī)藥股份有限公司,廣東深圳518001)
豬腹瀉是現(xiàn)代規(guī)模集約化養(yǎng)豬場的一種常見的多因素性疾病。在豬的疾病中,出現(xiàn)腹瀉癥狀的占35%~40%左右,尤其是仔豬,發(fā)病率更高,給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[1-2]。豬腹瀉性疾病致病因素復雜,豬只發(fā)病癥狀極為相似,臨床上很難診斷。引起豬腹瀉性疾病的病原體主要包括病毒,如豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒A、豬圓環(huán)病毒、高致病性藍耳病病毒;細菌,如致病性大腸埃希菌、巴氏桿菌、沙門菌、痢疾桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、葡萄球菌;寄生蟲,如附紅細胞體、弓形體、螺旋體等;其他因素,如飼料發(fā)霉變質(zhì)引起霉菌毒素中毒等。自從2010年12月以來,我國華東、華南、華北等部分地區(qū)出現(xiàn)以仔豬腹瀉為主要特征的疾病,導致仔豬死亡增加,給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失,對生豬養(yǎng)殖構(gòu)成了很大的危害。2013 年,豬流行性腹瀉病毒已蔓延美國13個州,造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1-3]。
為了對豬的主要病毒性腹瀉病進行研究,我們自2011年開始,連續(xù)3年對華南等地引起豬腹瀉的主要病毒進行了分離鑒定,并進行了流行病學調(diào)查。
1.1.1 病料和細胞系 從華南、江蘇等地9個豬場采集發(fā)生腹瀉、瀕臨死亡仔豬的小腸及內(nèi)容物、糞便、哺乳母豬的乳汁等臨床樣品共38 份。Vero-76傳代細胞系、猴腎傳代細胞系(MA-104),由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心動檢實驗室保存。
1.1.2 試劑與儀器 DMEM 營養(yǎng)液,Gibco公司產(chǎn)品;胰蛋白酶(Trypsin),Invitrogen公司產(chǎn)品;豬胰酶(porcine pancreatin),Sigma公司產(chǎn)品;雞IgY 純化試劑盒,Thermo 公司產(chǎn)品;TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒,Life tec公司產(chǎn)品;Qiagen Viral RNA Mini Kit,Qiagen公司產(chǎn)品;ABI 7500HT熒光定量PCR儀,Qiagen EZ1advanced全自動核酸抽提工作站。
1.2.1 樣品的采集與處理
1.2.1.1 樣品的采集 2011年,從華南地區(qū)3 個豬場采集具有腹瀉臨床癥狀的仔豬小腸內(nèi)容物、糞便、哺乳母豬的乳汁樣品12份;2012年從江蘇2個豬場采集糞便臨床樣品11份;2013年從深圳、廣州等4個豬場采集發(fā)生腹瀉、瀕臨死亡仔豬的小腸及內(nèi)容物、糞便,哺乳母豬的乳汁等臨床樣品15份。
1.2.1.2 樣品的處理 取小腸內(nèi)容物、乳汁和糞便樣品,用生理鹽水制成1∶10 的懸浮液,于4 ℃4 000r/min離心20 min,小心移去上層乳脂,取上清液經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾,收集濾液至少10 mL,分裝編號,置-80 ℃保存。
1.2.2 樣品的檢測與鑒定 將各編號的38份濾液于Qiagen EZ1advanced全自動核酸抽提工作站抽提核酸后,按照TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒說明書于ABI 7500HT 熒光定量PCR 儀進行檢測,分析檢測結(jié)果。
1.2.3 PEDV 分離與傳代 按常規(guī)方法復蘇Vero-76細胞和MA-104傳代細胞系,將細胞培養(yǎng)至單層時,每種細胞系分別接種編號為2011-PEDV-1、2012-PEDV-1和2013-PEDV-6的病毒濾液各1份,每瓶接種病料濾液1mL。接種病料濾液后的細胞37 ℃吸附1h,其間輕搖2次。吸附結(jié)束后,在Vero-76細胞培養(yǎng)瓶中,加入含有20μg/mL 胰酶、10 μg/mL豬胰酶和20 mL/L 胎牛血清的DMEM 維持液,37 ℃培養(yǎng)72h,作為一個傳代周期。傳代前,將上一次的細胞培養(yǎng)物反復凍融3次,按上述方法進行盲傳,顯微鏡觀察細胞病變,同時用TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒檢測。傳至第3代后,以后傳代時只加入含有10μg/mL 胰酶和20mL/L 胎牛血清的DMEM維持液,37 ℃培養(yǎng)72h,作為一個傳代周期。
1.2.4 PEDV 卵黃抗體的制備與純化 將2013-PEDV-6的第3 代細胞培養(yǎng)液經(jīng)超速離心后,按照常規(guī)方法采用5點法免疫注射蛋雞3次,收集高免蛋黃液。將高免蛋黃液采用水稀釋法和硫酸銨沉淀法進行粗提,再使用“雞IgY 純化試劑盒”進行純化,得到高純度的IgY 抗體。
1.2.5 PRoVA 的分離純化 將1.2.4中制備和純化獲得的抗PEDV 高免卵黃抗體,與2011年混合感染的PEDV 和PRoVA 的樣品編號為2011-PEDV+PRoVA-1的MA-104細胞培養(yǎng)液,按照1∶1的比例混合。放置于37 ℃中和30 min。再于MA-104細胞系上進行傳代。顯微鏡觀察細胞病變,同時用TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒檢測。再將傳代培養(yǎng)液繼續(xù)與PEDV 高免卵黃抗體反復中和、傳代和檢測,直至TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RTPCR檢測試劑盒檢測時PEDV 檢測結(jié)果為陰性。
3年從9 個豬場38 份臨床樣品采用TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒進行多重檢測。2011年12份樣品共檢測到PEDV 和PRoVA 混合感染陽性樣品2 份(編號:2011-PEDV+PRoVA-1 和2011-PEDV+PRoVA-2),只有PEDV 感染陽性樣品4份。選取PEDV 和PRoVA 的Ct 值均最低的編號為2011-PEDV+PRoVA-1的小腸內(nèi)容物樣品作為研究對象,熒光定量RT-PCR 擴增圖見圖1。2012年11份樣品共檢測到PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染陽性樣品6份,只有PEDV 感染陽性樣品3份。選取母豬乳汁樣品中Ct值均最低的編號為2012-PEDV+PRoVA+TGEV-3 的臨床樣品作為研究對象,熒光定量RT-PCR 擴增圖見圖2。2013 年15 份樣品僅檢測到PEDV 感染,且PEDV 均為陽性,無混合感染其他2種病毒。選取仔豬小腸內(nèi)容物樣品中Ct值最低編號為2013-PEDV-6的臨床樣品作為研究對象(熒光定量PCR 擴增圖略)。對9個豬場的3年豬腹瀉病毒性疾病流行病學調(diào)查表明,2011年—2013年主要是以PEDV 流行為主,各年份腹瀉病毒統(tǒng)計見圖3。
圖1 2011年2份樣品檢測為PEDV 和PRoVA混合感染的樣品檢測結(jié)果Fig.1 Two samples were positive for PEDV&PRoVA in 2011
樣品在Vero-76 傳代細胞系連傳,通過在前3代傳代細胞培養(yǎng)液中加入胰蛋白酶和豬胰酶,后續(xù)傳代中只加入胰蛋白酶的方式,成功實現(xiàn)了PEDV在Vero-76細胞上的連續(xù)傳代,且在第8 代出現(xiàn)了細胞病變(CPE)(圖4)。各代細胞培養(yǎng)上清液進行TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RTPCR檢測,均可檢測出PEDV,且Ct值隨著傳代次數(shù)的增加而減少,表明病毒滴度隨著傳代次數(shù)的增加而增加。
圖2 2012年編號為2012-PEDV+PRoVA+TGEV-3母豬乳汁樣品檢測為PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染Fig.2 Sow milk sample(2012-PEDV+PRoVA+TGEV-3)was positive for PEDV,TGEV&PRoVA in 2012
2011-PEDV+PRoVA-1 接種MA-104 細胞系后,第1代即出現(xiàn)細胞病變(圖5)。經(jīng)TGEV/PED V/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測,結(jié)果PEDV 和PRoVA 均為陽性。通過用2013-PEDV-6制備的高免血清,連續(xù)中和3 代,于MA-104混合感染的2011-PEDV+PRoVA-1細胞培養(yǎng)液,在第4代再次進行TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測,結(jié)果只有PRoVA為陽性,PEDV 檢測結(jié)果為陰性,表明成功分離純化出PRoVA,編號為2011-PRoVA-1。
圖3 2011年—2013年豬3種腹瀉性病毒檢測統(tǒng)計結(jié)果Fig.3 Statistical results of PEDV,TGEV&PRoVA among 2011-2013
圖4 Vero-76正常傳代細胞、接種PEDV 后第1代和出現(xiàn)CPE后的第8代細胞培養(yǎng)結(jié)果Fig.4 CPE of 8th passage and 1st of passage with PEDV and normal Vero-76cell line
圖5 MA-104正常傳代細胞、接種2011-PEDV+PRoVA-1毒株后第1代出現(xiàn)CPE Fig.5 CPE of 1st of passage with 2011-PEDV+PRoVA-1strain and normal MA-104cell line
自2011年開始,豬腹瀉性疾病在我國出現(xiàn)大規(guī)模流行,并有愈演愈烈的趨勢。在2011年采集的12份樣品中,檢測到有PEDV 感染或者PEDV 與PRoVA 混合感染的共有6份,其他樣品檢測結(jié)果3種病毒均為陰性。但不能排除剩余的6份樣品中有其他病毒、細菌或者寄生蟲。美國對2013年豬場豬腹瀉性疾病的普查結(jié)果顯示,豬場中有輪狀病毒C感染存在[4-5]。也有研究認為,從患有腹瀉性疾病的豬的臨床樣品中分離到產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌K88、K99、987P等,也有檢測到豬博卡病毒的[6-7]。在2012年11 份樣品中,共檢測到PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染陽性樣品6份??赡茉?011年出現(xiàn)豬腹瀉疫情后,各養(yǎng)殖豬場加大了豬腹瀉性疾病的防控,添加或使用抗菌藥物預防細菌性和寄生蟲性腹瀉,使用一些腹瀉病毒的疫苗,尤其是PEDV 活苗、TGEV活苗和PRoVA活苗來加大病毒性腹瀉疫病的控制,但效果不佳。在我們檢測到的3 種病毒中,TGEV和PRoVA可能來自疫苗毒,需要進一步測序確定。PEDV 分離株的S蛋白基因測序初步表明,與傳統(tǒng)的PEDV毒株差異較大,估計是發(fā)生了較大的變異所致。2013年,15份樣品中全部只分離到PEDV,并沒有分離到其他病毒,估計是豬場發(fā)現(xiàn)使用疫苗效果不理想后,暫時停止使用活苗進行免疫,所以只分離到了PEDV。這3 年引起豬腹瀉性疾病的主要病原體應該是PEDV 的變異株,而檢測到的TGEV 和PRoVA,可能是疫苗株,并不引發(fā)豬腹瀉。值得注意的是,在2012年和2013年,均采集了哺乳母豬的奶汁進行3種腹瀉性病毒的檢測,在母豬奶汁中發(fā)現(xiàn)大量的PEDV 存在,熒光定量RTPCR 的Ct值有時小于小豬小腸內(nèi)容物的Ct值,表明母豬奶汁中PEDV 的含量高于發(fā)病仔豬小腸中病毒含量。這與豬場反映剛出生的仔豬吃完母豬奶汁后即出現(xiàn)腹瀉的現(xiàn)象一致。盡管母豬不發(fā)病,建議有腹瀉病例的豬場,暫時停止喂飼剛出生的仔豬。流行病學調(diào)查表明,這次多個地區(qū)發(fā)生和流行仔豬腹瀉性疾病,主要病原是豬流行性腹瀉病毒。其次是傳染性胃腸炎病毒,也有豬輪狀病毒病、Kobu病毒等,部分養(yǎng)殖場還有致病性大腸埃希菌和沙門菌繼發(fā)感染[8-9]。
PEDV 和PRoVA 均可在MA-104細胞系、PK-15細胞系上生長,但需要經(jīng)過胰酶處理[10]。本研究由于沒有單獨分離到PRoVA,所以采用中和方法中和PEDV,成功分離純化到PRoVA。PRoVA 接種約48h后出現(xiàn)細胞病變(CPE),細胞腫脹變圓、折光性增強,顆粒物質(zhì)增多;隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞固縮、隆起、脫落,細胞間隙變大,到72h時細胞大量脫落(70%以上),瓶壁上的細胞拉成網(wǎng)狀。
由于PEDV 具有細胞毒性,很難在細胞上進行連續(xù)傳代[4]。本研究分離PEDV 時,采用了Vero-76細胞系,剛開始只加入了胰蛋白酶,連續(xù)盲傳3代,顯微鏡下觀察每代細胞培養(yǎng)狀況,發(fā)現(xiàn)PEDV 接種細胞后,第1、2、3代均不出現(xiàn)細胞病變。但在第4代傳代培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)病毒丟失現(xiàn)象,實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果為陰性。后來采取在第1代~3代添加大量胰蛋白酶,同時再添加了一定濃度的豬胰酶,成功實現(xiàn)了PEDV 在Vero細胞上的連續(xù)傳代。但在4代~8代的每次傳代后,細胞培養(yǎng)液中病毒的滴度開始下降,實時熒光定量RT-PCR 的Ct值增加。在傳至第8代后出現(xiàn)了細胞病變(cell pathogenic effect,CPE),細胞培養(yǎng)上清液中PEDV 的實時熒光定量RT-PCR檢測時Ct值逐步降低,表明自第8代出現(xiàn)CPE病變后,細胞培養(yǎng)液中的病毒滴度在不斷增加。
為了分離純化豬輪狀病毒A,用2013年分離到的PEDV 毒株制備卵黃抗體,純化抗體后中和2011年混合感染PEDV 和PRoVA 的MA-104細胞培養(yǎng)液,再于MA-104細胞系上進行傳代。通過不斷地中和傳代,經(jīng)多重實時熒光定量RT-PCR檢測,在第5代MA-104細胞培養(yǎng)液中只檢測到PRoVA,沒有檢測到PEDV,表明純化得到PRoVA。
通過本項目的研究,分離獲得了豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒A,并成功實現(xiàn)了細胞傳代,為疫苗的研發(fā)奠定了基礎。
[1]楊漢春.2013年豬病流行情況與2014年流行趨勢及防控對策[J].豬業(yè)科學,2014(2):42-43.
[2]張海明,田 野,王艷麗,等,豬流行性腹瀉病毒流行病學調(diào)查綜述[J].豬業(yè)科學,2014(3):90-91.
[3]楊麗梅,馬 力,徐倩倩,等,我國豬病毒性腹瀉的診斷與流行病學調(diào)查研究概況[J].動物醫(yī)學進展,2014,35(2):115-119.
[4]Kim S,Kim I,Pyo H,et al.Multiolex real-time RT-PCR for the simultaneous detection and quantification of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus[J].Virol Meth,2007,146(1-2):172-177.
[5]Amimo J O,Vlasova A N,Saif L J.Prevalence and genetic heterogeneity of porcine group C rotaviruses in nursing and weaned piglets in Ohio,USA and identification of a potential new VP4genotype[J].Vet Microbiol,2013,164:27-38.
[6]焦 洋,姜 焱,王凱民,等.豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬博卡病毒多重PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學進展,2013,34(8):71-75.
[7]魏海芳,王鴻忠.青海省部分地區(qū)PEDV、TGEV 和RV 感染情況調(diào)查與分析[J].動物醫(yī)學進展,2013,34(9):133-136.
[8]張 志,李 嵐,董雅琴,等.豬流行性腹瀉病毒PCR檢測及其M 基因的遺傳變異分析[J].動物醫(yī)學進展,2013,34(8):13-18.
[9]甘海霞,梁 晟,韋顯凱,等.2011年廣西豬群豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎調(diào)查[J].動物醫(yī)學進展,2012,33(6):125-127.
[10]尹寶英,吳旭錦,熊忙利.豬流行性腹瀉診斷方法研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2013,33(12):121-124.