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        引起豬腹瀉的病毒分離鑒定

        2014-06-17 02:38:52林慶燕陳書琨唐金明盧體康劉建利廖立珊曾少靈祁振強阮周曦呂建強楊俊興曹琛福張彩虹花群義秦智鋒
        動物醫(yī)學進展 2014年10期
        關(guān)鍵詞:傳代細胞系定量

        林慶燕,陳書琨,孫 潔,唐金明,2,陳 兵,盧體康,劉建利,廖立珊,曾少靈,祁振強,阮周曦,呂建強,楊俊興,曹琛福,張彩虹,花群義,秦智鋒*

        (1.深圳出入境檢驗檢疫局,廣東深圳518045;2.華南農(nóng)業(yè)大學,廣東廣州510642;3.深圳市寶舜泰生物醫(yī)藥股份有限公司,廣東深圳518001)

        豬腹瀉是現(xiàn)代規(guī)模集約化養(yǎng)豬場的一種常見的多因素性疾病。在豬的疾病中,出現(xiàn)腹瀉癥狀的占35%~40%左右,尤其是仔豬,發(fā)病率更高,給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失[1-2]。豬腹瀉性疾病致病因素復雜,豬只發(fā)病癥狀極為相似,臨床上很難診斷。引起豬腹瀉性疾病的病原體主要包括病毒,如豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒A、豬圓環(huán)病毒、高致病性藍耳病病毒;細菌,如致病性大腸埃希菌、巴氏桿菌、沙門菌、痢疾桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、葡萄球菌;寄生蟲,如附紅細胞體、弓形體、螺旋體等;其他因素,如飼料發(fā)霉變質(zhì)引起霉菌毒素中毒等。自從2010年12月以來,我國華東、華南、華北等部分地區(qū)出現(xiàn)以仔豬腹瀉為主要特征的疾病,導致仔豬死亡增加,給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失,對生豬養(yǎng)殖構(gòu)成了很大的危害。2013 年,豬流行性腹瀉病毒已蔓延美國13個州,造成了嚴重的經(jīng)濟損失[1-3]。

        為了對豬的主要病毒性腹瀉病進行研究,我們自2011年開始,連續(xù)3年對華南等地引起豬腹瀉的主要病毒進行了分離鑒定,并進行了流行病學調(diào)查。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 病料和細胞系 從華南、江蘇等地9個豬場采集發(fā)生腹瀉、瀕臨死亡仔豬的小腸及內(nèi)容物、糞便、哺乳母豬的乳汁等臨床樣品共38 份。Vero-76傳代細胞系、猴腎傳代細胞系(MA-104),由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心動檢實驗室保存。

        1.1.2 試劑與儀器 DMEM 營養(yǎng)液,Gibco公司產(chǎn)品;胰蛋白酶(Trypsin),Invitrogen公司產(chǎn)品;豬胰酶(porcine pancreatin),Sigma公司產(chǎn)品;雞IgY 純化試劑盒,Thermo 公司產(chǎn)品;TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒,Life tec公司產(chǎn)品;Qiagen Viral RNA Mini Kit,Qiagen公司產(chǎn)品;ABI 7500HT熒光定量PCR儀,Qiagen EZ1advanced全自動核酸抽提工作站。

        1.2 方法

        1.2.1 樣品的采集與處理

        1.2.1.1 樣品的采集 2011年,從華南地區(qū)3 個豬場采集具有腹瀉臨床癥狀的仔豬小腸內(nèi)容物、糞便、哺乳母豬的乳汁樣品12份;2012年從江蘇2個豬場采集糞便臨床樣品11份;2013年從深圳、廣州等4個豬場采集發(fā)生腹瀉、瀕臨死亡仔豬的小腸及內(nèi)容物、糞便,哺乳母豬的乳汁等臨床樣品15份。

        1.2.1.2 樣品的處理 取小腸內(nèi)容物、乳汁和糞便樣品,用生理鹽水制成1∶10 的懸浮液,于4 ℃4 000r/min離心20 min,小心移去上層乳脂,取上清液經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾,收集濾液至少10 mL,分裝編號,置-80 ℃保存。

        1.2.2 樣品的檢測與鑒定 將各編號的38份濾液于Qiagen EZ1advanced全自動核酸抽提工作站抽提核酸后,按照TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒說明書于ABI 7500HT 熒光定量PCR 儀進行檢測,分析檢測結(jié)果。

        1.2.3 PEDV 分離與傳代 按常規(guī)方法復蘇Vero-76細胞和MA-104傳代細胞系,將細胞培養(yǎng)至單層時,每種細胞系分別接種編號為2011-PEDV-1、2012-PEDV-1和2013-PEDV-6的病毒濾液各1份,每瓶接種病料濾液1mL。接種病料濾液后的細胞37 ℃吸附1h,其間輕搖2次。吸附結(jié)束后,在Vero-76細胞培養(yǎng)瓶中,加入含有20μg/mL 胰酶、10 μg/mL豬胰酶和20 mL/L 胎牛血清的DMEM 維持液,37 ℃培養(yǎng)72h,作為一個傳代周期。傳代前,將上一次的細胞培養(yǎng)物反復凍融3次,按上述方法進行盲傳,顯微鏡觀察細胞病變,同時用TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒檢測。傳至第3代后,以后傳代時只加入含有10μg/mL 胰酶和20mL/L 胎牛血清的DMEM維持液,37 ℃培養(yǎng)72h,作為一個傳代周期。

        1.2.4 PEDV 卵黃抗體的制備與純化 將2013-PEDV-6的第3 代細胞培養(yǎng)液經(jīng)超速離心后,按照常規(guī)方法采用5點法免疫注射蛋雞3次,收集高免蛋黃液。將高免蛋黃液采用水稀釋法和硫酸銨沉淀法進行粗提,再使用“雞IgY 純化試劑盒”進行純化,得到高純度的IgY 抗體。

        1.2.5 PRoVA 的分離純化 將1.2.4中制備和純化獲得的抗PEDV 高免卵黃抗體,與2011年混合感染的PEDV 和PRoVA 的樣品編號為2011-PEDV+PRoVA-1的MA-104細胞培養(yǎng)液,按照1∶1的比例混合。放置于37 ℃中和30 min。再于MA-104細胞系上進行傳代。顯微鏡觀察細胞病變,同時用TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒檢測。再將傳代培養(yǎng)液繼續(xù)與PEDV 高免卵黃抗體反復中和、傳代和檢測,直至TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RTPCR檢測試劑盒檢測時PEDV 檢測結(jié)果為陰性。

        2 結(jié)果

        2.1 多重實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果

        3年從9 個豬場38 份臨床樣品采用TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒進行多重檢測。2011年12份樣品共檢測到PEDV 和PRoVA 混合感染陽性樣品2 份(編號:2011-PEDV+PRoVA-1 和2011-PEDV+PRoVA-2),只有PEDV 感染陽性樣品4份。選取PEDV 和PRoVA 的Ct 值均最低的編號為2011-PEDV+PRoVA-1的小腸內(nèi)容物樣品作為研究對象,熒光定量RT-PCR 擴增圖見圖1。2012年11份樣品共檢測到PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染陽性樣品6份,只有PEDV 感染陽性樣品3份。選取母豬乳汁樣品中Ct值均最低的編號為2012-PEDV+PRoVA+TGEV-3 的臨床樣品作為研究對象,熒光定量RT-PCR 擴增圖見圖2。2013 年15 份樣品僅檢測到PEDV 感染,且PEDV 均為陽性,無混合感染其他2種病毒。選取仔豬小腸內(nèi)容物樣品中Ct值最低編號為2013-PEDV-6的臨床樣品作為研究對象(熒光定量PCR 擴增圖略)。對9個豬場的3年豬腹瀉病毒性疾病流行病學調(diào)查表明,2011年—2013年主要是以PEDV 流行為主,各年份腹瀉病毒統(tǒng)計見圖3。

        圖1 2011年2份樣品檢測為PEDV 和PRoVA混合感染的樣品檢測結(jié)果Fig.1 Two samples were positive for PEDV&PRoVA in 2011

        2.2 PEDV的細胞分離與傳代結(jié)果

        樣品在Vero-76 傳代細胞系連傳,通過在前3代傳代細胞培養(yǎng)液中加入胰蛋白酶和豬胰酶,后續(xù)傳代中只加入胰蛋白酶的方式,成功實現(xiàn)了PEDV在Vero-76細胞上的連續(xù)傳代,且在第8 代出現(xiàn)了細胞病變(CPE)(圖4)。各代細胞培養(yǎng)上清液進行TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RTPCR檢測,均可檢測出PEDV,且Ct值隨著傳代次數(shù)的增加而減少,表明病毒滴度隨著傳代次數(shù)的增加而增加。

        圖2 2012年編號為2012-PEDV+PRoVA+TGEV-3母豬乳汁樣品檢測為PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染Fig.2 Sow milk sample(2012-PEDV+PRoVA+TGEV-3)was positive for PEDV,TGEV&PRoVA in 2012

        2.3 PRoVA 分離與純化結(jié)果

        2011-PEDV+PRoVA-1 接種MA-104 細胞系后,第1代即出現(xiàn)細胞病變(圖5)。經(jīng)TGEV/PED V/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測,結(jié)果PEDV 和PRoVA 均為陽性。通過用2013-PEDV-6制備的高免血清,連續(xù)中和3 代,于MA-104混合感染的2011-PEDV+PRoVA-1細胞培養(yǎng)液,在第4代再次進行TGEV/PEDV/Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測,結(jié)果只有PRoVA為陽性,PEDV 檢測結(jié)果為陰性,表明成功分離純化出PRoVA,編號為2011-PRoVA-1。

        圖3 2011年—2013年豬3種腹瀉性病毒檢測統(tǒng)計結(jié)果Fig.3 Statistical results of PEDV,TGEV&PRoVA among 2011-2013

        圖4 Vero-76正常傳代細胞、接種PEDV 后第1代和出現(xiàn)CPE后的第8代細胞培養(yǎng)結(jié)果Fig.4 CPE of 8th passage and 1st of passage with PEDV and normal Vero-76cell line

        圖5 MA-104正常傳代細胞、接種2011-PEDV+PRoVA-1毒株后第1代出現(xiàn)CPE Fig.5 CPE of 1st of passage with 2011-PEDV+PRoVA-1strain and normal MA-104cell line

        3 討論

        3.1 豬腹瀉性疾病流行病學分析

        自2011年開始,豬腹瀉性疾病在我國出現(xiàn)大規(guī)模流行,并有愈演愈烈的趨勢。在2011年采集的12份樣品中,檢測到有PEDV 感染或者PEDV 與PRoVA 混合感染的共有6份,其他樣品檢測結(jié)果3種病毒均為陰性。但不能排除剩余的6份樣品中有其他病毒、細菌或者寄生蟲。美國對2013年豬場豬腹瀉性疾病的普查結(jié)果顯示,豬場中有輪狀病毒C感染存在[4-5]。也有研究認為,從患有腹瀉性疾病的豬的臨床樣品中分離到產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌K88、K99、987P等,也有檢測到豬博卡病毒的[6-7]。在2012年11 份樣品中,共檢測到PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染陽性樣品6份??赡茉?011年出現(xiàn)豬腹瀉疫情后,各養(yǎng)殖豬場加大了豬腹瀉性疾病的防控,添加或使用抗菌藥物預防細菌性和寄生蟲性腹瀉,使用一些腹瀉病毒的疫苗,尤其是PEDV 活苗、TGEV活苗和PRoVA活苗來加大病毒性腹瀉疫病的控制,但效果不佳。在我們檢測到的3 種病毒中,TGEV和PRoVA可能來自疫苗毒,需要進一步測序確定。PEDV 分離株的S蛋白基因測序初步表明,與傳統(tǒng)的PEDV毒株差異較大,估計是發(fā)生了較大的變異所致。2013年,15份樣品中全部只分離到PEDV,并沒有分離到其他病毒,估計是豬場發(fā)現(xiàn)使用疫苗效果不理想后,暫時停止使用活苗進行免疫,所以只分離到了PEDV。這3 年引起豬腹瀉性疾病的主要病原體應該是PEDV 的變異株,而檢測到的TGEV 和PRoVA,可能是疫苗株,并不引發(fā)豬腹瀉。值得注意的是,在2012年和2013年,均采集了哺乳母豬的奶汁進行3種腹瀉性病毒的檢測,在母豬奶汁中發(fā)現(xiàn)大量的PEDV 存在,熒光定量RTPCR 的Ct值有時小于小豬小腸內(nèi)容物的Ct值,表明母豬奶汁中PEDV 的含量高于發(fā)病仔豬小腸中病毒含量。這與豬場反映剛出生的仔豬吃完母豬奶汁后即出現(xiàn)腹瀉的現(xiàn)象一致。盡管母豬不發(fā)病,建議有腹瀉病例的豬場,暫時停止喂飼剛出生的仔豬。流行病學調(diào)查表明,這次多個地區(qū)發(fā)生和流行仔豬腹瀉性疾病,主要病原是豬流行性腹瀉病毒。其次是傳染性胃腸炎病毒,也有豬輪狀病毒病、Kobu病毒等,部分養(yǎng)殖場還有致病性大腸埃希菌和沙門菌繼發(fā)感染[8-9]。

        3.2 PEDV 和PRoVA 的分離培養(yǎng)

        PEDV 和PRoVA 均可在MA-104細胞系、PK-15細胞系上生長,但需要經(jīng)過胰酶處理[10]。本研究由于沒有單獨分離到PRoVA,所以采用中和方法中和PEDV,成功分離純化到PRoVA。PRoVA 接種約48h后出現(xiàn)細胞病變(CPE),細胞腫脹變圓、折光性增強,顆粒物質(zhì)增多;隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞固縮、隆起、脫落,細胞間隙變大,到72h時細胞大量脫落(70%以上),瓶壁上的細胞拉成網(wǎng)狀。

        由于PEDV 具有細胞毒性,很難在細胞上進行連續(xù)傳代[4]。本研究分離PEDV 時,采用了Vero-76細胞系,剛開始只加入了胰蛋白酶,連續(xù)盲傳3代,顯微鏡下觀察每代細胞培養(yǎng)狀況,發(fā)現(xiàn)PEDV 接種細胞后,第1、2、3代均不出現(xiàn)細胞病變。但在第4代傳代培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)病毒丟失現(xiàn)象,實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果為陰性。后來采取在第1代~3代添加大量胰蛋白酶,同時再添加了一定濃度的豬胰酶,成功實現(xiàn)了PEDV 在Vero細胞上的連續(xù)傳代。但在4代~8代的每次傳代后,細胞培養(yǎng)液中病毒的滴度開始下降,實時熒光定量RT-PCR 的Ct值增加。在傳至第8代后出現(xiàn)了細胞病變(cell pathogenic effect,CPE),細胞培養(yǎng)上清液中PEDV 的實時熒光定量RT-PCR檢測時Ct值逐步降低,表明自第8代出現(xiàn)CPE病變后,細胞培養(yǎng)液中的病毒滴度在不斷增加。

        為了分離純化豬輪狀病毒A,用2013年分離到的PEDV 毒株制備卵黃抗體,純化抗體后中和2011年混合感染PEDV 和PRoVA 的MA-104細胞培養(yǎng)液,再于MA-104細胞系上進行傳代。通過不斷地中和傳代,經(jīng)多重實時熒光定量RT-PCR檢測,在第5代MA-104細胞培養(yǎng)液中只檢測到PRoVA,沒有檢測到PEDV,表明純化得到PRoVA。

        通過本項目的研究,分離獲得了豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒A,并成功實現(xiàn)了細胞傳代,為疫苗的研發(fā)奠定了基礎。

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