林慶燕，陳書琨，孫 潔，唐金明，2，陳 兵，盧體康，劉建利，廖立珊，曾少靈，祁振強，阮周曦，呂建強，楊俊興，曹琛福，張彩虹，花群義，秦智鋒＊

（1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳518045；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州510642；3.深圳市寶舜泰生物醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳518001）

豬腹瀉是現(xiàn)代規(guī)模集約化養(yǎng)豬場的一種常見的多因素性疾病。在豬的疾病中，出現(xiàn)腹瀉癥狀的占35%～40%左右，尤其是仔豬，發(fā)病率更高，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失［1-2］。豬腹瀉性疾病致病因素復(fù)雜，豬只發(fā)病癥狀極為相似，臨床上很難診斷。引起豬腹瀉性疾病的病原體主要包括病毒，如豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒A、豬圓環(huán)病毒、高致病性藍耳病病毒；細(xì)菌，如致病性大腸埃希菌、巴氏桿菌、沙門菌、痢疾桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、葡萄球菌；寄生蟲，如附紅細(xì)胞體、弓形體、螺旋體等；其他因素，如飼料發(fā)霉變質(zhì)引起霉菌毒素中毒等。自從2010年12月以來，我國華東、華南、華北等部分地區(qū)出現(xiàn)以仔豬腹瀉為主要特征的疾病，導(dǎo)致仔豬死亡增加，給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失，對生豬養(yǎng)殖構(gòu)成了很大的危害。2013 年，豬流行性腹瀉病毒已蔓延美國13個州，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失［1-3］。

為了對豬的主要病毒性腹瀉病進行研究，我們自2011年開始，連續(xù)3年對華南等地引起豬腹瀉的主要病毒進行了分離鑒定，并進行了流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料和細(xì)胞系 從華南、江蘇等地9個豬場采集發(fā)生腹瀉、瀕臨死亡仔豬的小腸及內(nèi)容物、糞便、哺乳母豬的乳汁等臨床樣品共38 份。Vero-76傳代細(xì)胞系、猴腎傳代細(xì)胞系（MA-104），由深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心動檢實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 DMEM 營養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶（Trypsin），Invitrogen公司產(chǎn)品；豬胰酶（porcine pancreatin），Sigma公司產(chǎn)品；雞IgY 純化試劑盒，Thermo 公司產(chǎn)品；TGEV／PEDV／Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，Life tec公司產(chǎn)品；Qiagen Viral RNA Mini Kit，Qiagen公司產(chǎn)品；ABI 7500HT熒光定量PCR儀，Qiagen EZ1advanced全自動核酸抽提工作站。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理

1.2.1.1 樣品的采集 2011年，從華南地區(qū)3 個豬場采集具有腹瀉臨床癥狀的仔豬小腸內(nèi)容物、糞便、哺乳母豬的乳汁樣品12份；2012年從江蘇2個豬場采集糞便臨床樣品11份；2013年從深圳、廣州等4個豬場采集發(fā)生腹瀉、瀕臨死亡仔豬的小腸及內(nèi)容物、糞便，哺乳母豬的乳汁等臨床樣品15份。

1.2.1.2 樣品的處理 取小腸內(nèi)容物、乳汁和糞便樣品，用生理鹽水制成1∶10 的懸浮液，于4 ℃4 000r／min離心20 min，小心移去上層乳脂，取上清液經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾，收集濾液至少10 mL，分裝編號，置-80 ℃保存。

1.2.2 樣品的檢測與鑒定 將各編號的38份濾液于Qiagen EZ1advanced全自動核酸抽提工作站抽提核酸后，按照TGEV／PEDV／Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒說明書于ABI 7500HT 熒光定量PCR 儀進行檢測，分析檢測結(jié)果。

1.2.3 PEDV 分離與傳代 按常規(guī)方法復(fù)蘇Vero-76細(xì)胞和MA-104傳代細(xì)胞系，將細(xì)胞培養(yǎng)至單層時，每種細(xì)胞系分別接種編號為2011-PEDV-1、2012-PEDV-1和2013-PEDV-6的病毒濾液各1份，每瓶接種病料濾液1mL。接種病料濾液后的細(xì)胞37 ℃吸附1h，其間輕搖2次。吸附結(jié)束后，在Vero-76細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含有20μg／mL 胰酶、10 μg／mL豬胰酶和20 mL／L 胎牛血清的DMEM 維持液，37 ℃培養(yǎng)72h，作為一個傳代周期。傳代前，將上一次的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，按上述方法進行盲傳，顯微鏡觀察細(xì)胞病變，同時用TGEV／PEDV／Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒檢測。傳至第3代后，以后傳代時只加入含有10μg／mL 胰酶和20mL／L 胎牛血清的DMEM維持液，37 ℃培養(yǎng)72h，作為一個傳代周期。

1.2.4 PEDV 卵黃抗體的制備與純化 將2013-PEDV-6的第3 代細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)超速離心后，按照常規(guī)方法采用5點法免疫注射蛋雞3次，收集高免蛋黃液。將高免蛋黃液采用水稀釋法和硫酸銨沉淀法進行粗提，再使用“雞IgY 純化試劑盒”進行純化，得到高純度的IgY 抗體。

1.2.5 PRoVA 的分離純化 將1.2.4中制備和純化獲得的抗PEDV 高免卵黃抗體，與2011年混合感染的PEDV 和PRoVA 的樣品編號為2011-PEDV＋PRoVA-1的MA-104細(xì)胞培養(yǎng)液，按照1∶1的比例混合。放置于37 ℃中和30 min。再于MA-104細(xì)胞系上進行傳代。顯微鏡觀察細(xì)胞病變，同時用TGEV／PEDV／Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒檢測。再將傳代培養(yǎng)液繼續(xù)與PEDV 高免卵黃抗體反復(fù)中和、傳代和檢測，直至TGEV／PEDV／Rotavirus三重實時熒光定量RTPCR檢測試劑盒檢測時PEDV 檢測結(jié)果為陰性。

2 結(jié)果

2.1 多重實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果

3年從9 個豬場38 份臨床樣品采用TGEV／PEDV／Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒進行多重檢測。2011年12份樣品共檢測到PEDV 和PRoVA 混合感染陽性樣品2 份（編號：2011-PEDV＋PRoVA-1 和2011-PEDV＋PRoVA-2），只有PEDV 感染陽性樣品4份。選取PEDV 和PRoVA 的Ct 值均最低的編號為2011-PEDV＋PRoVA-1的小腸內(nèi)容物樣品作為研究對象，熒光定量RT-PCR 擴增圖見圖1。2012年11份樣品共檢測到PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染陽性樣品6份，只有PEDV 感染陽性樣品3份。選取母豬乳汁樣品中Ct值均最低的編號為2012-PEDV＋PRoVA＋TGEV-3 的臨床樣品作為研究對象，熒光定量RT-PCR 擴增圖見圖2。2013 年15 份樣品僅檢測到PEDV 感染，且PEDV 均為陽性，無混合感染其他2種病毒。選取仔豬小腸內(nèi)容物樣品中Ct值最低編號為2013-PEDV-6的臨床樣品作為研究對象（熒光定量PCR 擴增圖略）。對9個豬場的3年豬腹瀉病毒性疾病流行病學(xué)調(diào)查表明，2011年—2013年主要是以PEDV 流行為主，各年份腹瀉病毒統(tǒng)計見圖3。

圖1 2011年2份樣品檢測為PEDV 和PRoVA混合感染的樣品檢測結(jié)果Fig.1 Two samples were positive for PEDV＆PRoVA in 2011

2.2 PEDV的細(xì)胞分離與傳代結(jié)果

樣品在Vero-76 傳代細(xì)胞系連傳，通過在前3代傳代細(xì)胞培養(yǎng)液中加入胰蛋白酶和豬胰酶，后續(xù)傳代中只加入胰蛋白酶的方式，成功實現(xiàn)了PEDV在Vero-76細(xì)胞上的連續(xù)傳代，且在第8 代出現(xiàn)了細(xì)胞病變（CPE）（圖4）。各代細(xì)胞培養(yǎng)上清液進行TGEV／PEDV／Rotavirus三重實時熒光定量RTPCR檢測，均可檢測出PEDV，且Ct值隨著傳代次數(shù)的增加而減少，表明病毒滴度隨著傳代次數(shù)的增加而增加。

圖2 2012年編號為2012-PEDV＋PRoVA＋TGEV-3母豬乳汁樣品檢測為PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染Fig.2 Sow milk sample（2012-PEDV＋PRoVA＋TGEV-3）was positive for PEDV，TGEV＆PRoVA in 2012

2.3 PRoVA 分離與純化結(jié)果

2011-PEDV＋PRoVA-1 接種MA-104 細(xì)胞系后，第1代即出現(xiàn)細(xì)胞病變（圖5）。經(jīng)TGEV／PED V／Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測，結(jié)果PEDV 和PRoVA 均為陽性。通過用2013-PEDV-6制備的高免血清，連續(xù)中和3 代，于MA-104混合感染的2011-PEDV＋PRoVA-1細(xì)胞培養(yǎng)液，在第4代再次進行TGEV／PEDV／Rotavirus三重實時熒光定量RT-PCR檢測，結(jié)果只有PRoVA為陽性，PEDV 檢測結(jié)果為陰性，表明成功分離純化出PRoVA，編號為2011-PRoVA-1。

圖3 2011年—2013年豬3種腹瀉性病毒檢測統(tǒng)計結(jié)果Fig.3 Statistical results of PEDV，TGEV＆PRoVA among 2011-2013

圖4 Vero-76正常傳代細(xì)胞、接種PEDV 后第1代和出現(xiàn)CPE后的第8代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果Fig.4 CPE of 8th passage and 1st of passage with PEDV and normal Vero-76cell line

圖5 MA-104正常傳代細(xì)胞、接種2011-PEDV＋PRoVA-1毒株后第1代出現(xiàn)CPE Fig.5 CPE of 1st of passage with 2011-PEDV＋PRoVA-1strain and normal MA-104cell line

3 討論

3.1 豬腹瀉性疾病流行病學(xué)分析

自2011年開始，豬腹瀉性疾病在我國出現(xiàn)大規(guī)模流行，并有愈演愈烈的趨勢。在2011年采集的12份樣品中，檢測到有PEDV 感染或者PEDV 與PRoVA 混合感染的共有6份，其他樣品檢測結(jié)果3種病毒均為陰性。但不能排除剩余的6份樣品中有其他病毒、細(xì)菌或者寄生蟲。美國對2013年豬場豬腹瀉性疾病的普查結(jié)果顯示，豬場中有輪狀病毒C感染存在［4-5］。也有研究認(rèn)為，從患有腹瀉性疾病的豬的臨床樣品中分離到產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌K88、K99、987P等，也有檢測到豬博卡病毒的［6-7］。在2012年11 份樣品中，共檢測到PEDV、TGEV 和PRoVA 混合感染陽性樣品6份?？赡茉?011年出現(xiàn)豬腹瀉疫情后，各養(yǎng)殖豬場加大了豬腹瀉性疾病的防控，添加或使用抗菌藥物預(yù)防細(xì)菌性和寄生蟲性腹瀉，使用一些腹瀉病毒的疫苗，尤其是PEDV 活苗、TGEV活苗和PRoVA活苗來加大病毒性腹瀉疫病的控制，但效果不佳。在我們檢測到的3 種病毒中，TGEV和PRoVA可能來自疫苗毒，需要進一步測序確定。PEDV 分離株的S蛋白基因測序初步表明，與傳統(tǒng)的PEDV毒株差異較大，估計是發(fā)生了較大的變異所致。2013年，15份樣品中全部只分離到PEDV，并沒有分離到其他病毒，估計是豬場發(fā)現(xiàn)使用疫苗效果不理想后，暫時停止使用活苗進行免疫，所以只分離到了PEDV。這3 年引起豬腹瀉性疾病的主要病原體應(yīng)該是PEDV 的變異株，而檢測到的TGEV 和PRoVA，可能是疫苗株，并不引發(fā)豬腹瀉。值得注意的是，在2012年和2013年，均采集了哺乳母豬的奶汁進行3種腹瀉性病毒的檢測，在母豬奶汁中發(fā)現(xiàn)大量的PEDV 存在，熒光定量RTPCR 的Ct值有時小于小豬小腸內(nèi)容物的Ct值，表明母豬奶汁中PEDV 的含量高于發(fā)病仔豬小腸中病毒含量。這與豬場反映剛出生的仔豬吃完母豬奶汁后即出現(xiàn)腹瀉的現(xiàn)象一致。盡管母豬不發(fā)病，建議有腹瀉病例的豬場，暫時停止喂飼剛出生的仔豬。流行病學(xué)調(diào)查表明，這次多個地區(qū)發(fā)生和流行仔豬腹瀉性疾病，主要病原是豬流行性腹瀉病毒。其次是傳染性胃腸炎病毒，也有豬輪狀病毒病、Kobu病毒等，部分養(yǎng)殖場還有致病性大腸埃希菌和沙門菌繼發(fā)感染［8-9］。

3.2 PEDV 和PRoVA 的分離培養(yǎng)

PEDV 和PRoVA 均可在MA-104細(xì)胞系、PK-15細(xì)胞系上生長，但需要經(jīng)過胰酶處理［10］。本研究由于沒有單獨分離到PRoVA，所以采用中和方法中和PEDV，成功分離純化到PRoVA。PRoVA 接種約48h后出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），細(xì)胞腫脹變圓、折光性增強，顆粒物質(zhì)增多；隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞固縮、隆起、脫落，細(xì)胞間隙變大，到72h時細(xì)胞大量脫落（70%以上），瓶壁上的細(xì)胞拉成網(wǎng)狀。

由于PEDV 具有細(xì)胞毒性，很難在細(xì)胞上進行連續(xù)傳代［4］。本研究分離PEDV 時，采用了Vero-76細(xì)胞系，剛開始只加入了胰蛋白酶，連續(xù)盲傳3代，顯微鏡下觀察每代細(xì)胞培養(yǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)PEDV 接種細(xì)胞后，第1、2、3代均不出現(xiàn)細(xì)胞病變。但在第4代傳代培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)病毒丟失現(xiàn)象，實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果為陰性。后來采取在第1代～3代添加大量胰蛋白酶，同時再添加了一定濃度的豬胰酶，成功實現(xiàn)了PEDV 在Vero細(xì)胞上的連續(xù)傳代。但在4代～8代的每次傳代后，細(xì)胞培養(yǎng)液中病毒的滴度開始下降，實時熒光定量RT-PCR 的Ct值增加。在傳至第8代后出現(xiàn)了細(xì)胞病變（cell pathogenic effect，CPE），細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PEDV 的實時熒光定量RT-PCR檢測時Ct值逐步降低，表明自第8代出現(xiàn)CPE病變后，細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒滴度在不斷增加。

為了分離純化豬輪狀病毒A，用2013年分離到的PEDV 毒株制備卵黃抗體，純化抗體后中和2011年混合感染PEDV 和PRoVA 的MA-104細(xì)胞培養(yǎng)液，再于MA-104細(xì)胞系上進行傳代。通過不斷地中和傳代，經(jīng)多重實時熒光定量RT-PCR檢測，在第5代MA-104細(xì)胞培養(yǎng)液中只檢測到PRoVA，沒有檢測到PEDV，表明純化得到PRoVA。

通過本項目的研究，分離獲得了豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒A，并成功實現(xiàn)了細(xì)胞傳代，為疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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