肖月蕊，顏瑞萍，李明義，高 軒＊

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定071000；2.諸城市畜牧獸醫(yī)管理局，山東諸城262200；3.山東信得科技股份有限公司，山東青島266101）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）為正 黏病毒科A 型流感病毒，屬于單股負(fù)鏈RNA 病毒。禽流感病毒的基因組分為HA、NA、NP、PA、PB1、PB2、M 和NS8個片段。其中PB1、PB2和PA 3個蛋白組成病毒的RNA 聚合酶，NP和M1稱為病毒的內(nèi)源蛋白，HA、NA 和M2 為外源蛋白，NS1 和NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白［1］。AIV 變異頻繁，血清亞型眾多，根據(jù)流感病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）抗原性的差異可分為不同的亞型［2］。在眾多亞型中，H9N2亞型禽流感病毒雖然為中低致病力毒株，但對養(yǎng)禽業(yè)的危害不容忽視，1996年—2000年，H9N2亞型禽流感的發(fā)病率占總禽流感發(fā)病的93.89%，成為影響我國養(yǎng)禽業(yè)的主要AIV 亞型［3-4］。

1994年的A／Chicken／Beijing／1／94（H9N2）分離株曾給我國養(yǎng)禽業(yè)造成極大損失，唐秀英等［5］也先后從發(fā)病禽中分離到大量的H9N2亞型禽流感病毒，其公共衛(wèi)生意義引起了全世界的廣泛關(guān)注，對該亞型病毒的研究也取得了較大的進(jìn)展，其中應(yīng)用比較廣泛的技術(shù)為反向遺傳操作技術(shù)。雖然傳統(tǒng)疫苗在保護(hù)畜禽免受禽流感感染的過程中起到了不可替代的作用，但傳統(tǒng)疫苗受制作工藝的限制，其在保存、使用和接種后的副作用等方面都會影響免疫效力。因此有必要研制新型疫苗來彌補(bǔ)其不足之處［6］。流感病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)可以在分子水平上研究流感病毒的生活周期，了解流感病毒的致病機(jī)制和生物學(xué)特性，并且可以研制安全有效的新型流感疫苗［7］。反向遺傳操作技術(shù)最具潛力、最具吸引力的應(yīng)用還在于流感疫苗株的篩選。一方面因為其疫苗株篩選的時間短，可以解決流感大流行發(fā)生時疫苗生產(chǎn)的時效問題，為流感流行期間流感疫苗的制備爭取時間；另一方面可以構(gòu)建在動物細(xì)胞傳代中高度增殖的疫苗株，而不是常用的利用雞胚進(jìn)行病毒增殖的方法，這在大大降低生產(chǎn)成本的同時也避免了病毒增殖后雞胚殘體的焚燒，降低了對環(huán)境污染［8］。12或17質(zhì)粒系統(tǒng)［9］的建立，開創(chuàng)了該系統(tǒng)的新篇章，與以前的一些方法相比比較簡便，不再需要輔助病毒，避免了繁重的篩選工作。但其最大的缺點就是質(zhì)粒比較多，工作量大，最后拯救的結(jié)果往往不是很理想，Hoffmann E等［10］創(chuàng)建的8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)為流感病毒疫苗候選株的快速篩選提供了可能，為人類在反向遺傳系統(tǒng)的研究開啟了新的篇章。

本研究以H1N1 亞型禽流感病毒的6 個基因片段（PB2、PB1、PA、M、NP和NS）和H9N2亞型禽流感病毒的2 個基因片段（NA 和HA）為基因供體，構(gòu)建與H9N2亞型流感病毒具有相同基因組合方式的重組病毒。并研究了該重組病毒在293T 和MDCK 細(xì)胞上的生長特性，對其安全性、穩(wěn)定性進(jìn)行了初步評價，為H9 亞型禽流感疫苗的研制開辟了新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與質(zhì)粒 H9N2亞型禽流感病毒山東地區(qū)分離株，由本實驗室（山東信得科技股份有限公司青島研發(fā)中心）分離、鑒定和保存。已構(gòu)建好的含有H1N1流感病毒6個基因片段的pHW2000載體（pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-M、pHW2000-NP 和pHW2000-NS），用于cDNA 克隆的雙向轉(zhuǎn)錄／表達(dá)空載體pHW2000，由本實驗室保存。

1.1.2 細(xì)胞 DH 5α大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞購自北京博邁德科技股份有限公司。人胚腎T 細(xì)胞（293T）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞），由本實驗室保存。

1.1.3 實驗動物 10dSPF 雞胚，為山東省家禽研究所產(chǎn)品。

1.1.4 主要試劑 T4DNA 連接酶、RNasin（RNA酶抑制劑）、pMD18-T vector、DNA Marker 2 000、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker、IPTG，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶StuⅠ （10 U／μL）、dNTPs、L-LMV 反轉(zhuǎn)錄酶，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；RNA 提取試劑TRIzols、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000、OPTI-MEM、Expand High FidelityTaq酶，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取純化試劑盒，Invitrogen公司產(chǎn)品；Agrose Gel DNA 回收試劑盒，OMEGA 公司產(chǎn)品；TPCK 處理的胰酶，Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM、胎牛血清，GIBICO 公司產(chǎn)品；BsmBⅠ（10 U／μL）和BsaⅠ（10 U／μL），NEB公司產(chǎn)品。10mL／L 雞紅細(xì)胞按常規(guī)方法自行制備。

1.1.5 試驗用溶液及其配制 氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、SOC培養(yǎng)基、X-gal、IPTG、50×TA、生理鹽水，均由本實驗室配制。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 引物設(shè)計參考Hoffman E等［11］報道，設(shè)計擴(kuò)增流感病毒HA 和NA 全基因引物，引物序列如下：Bm-HA-1：5′-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3′；Bm-HA-2：5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3′； Ba-NA-1：5′-TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT-3′； Ba-NA-2：5′-ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT-3′。

引物序列中有BsmBⅠ和BsaⅠ酶切位點，反轉(zhuǎn)錄通用引物為Unit12。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 病毒RNA 提取和cDNA 的合成 用OMEGA 公司總RNA 提取試劑盒從含有H9N2亞型禽流感病毒的尿囊液中提取病毒RNA，按Hoffmann E等［12］的方法進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。取病毒RNA 懸液29μL，與2μL反轉(zhuǎn)錄引物混勻后置于65 ℃水浴5min，取出后冰浴5min，依次加入5×RT buffer 10 μL，10mmoL／L dNTPs 5μL，RNasin（40U／μL）1.5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶AMV（10U／μL）1μL，42 ℃反應(yīng)60 min。將HA 基因和NA 基因反轉(zhuǎn)錄后的cDNA產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.3 HA 和NA 基因的擴(kuò)增 以1.2.2中所得產(chǎn)物為模板擴(kuò)增各基因片段，PCR反應(yīng)體系為：10×Expand FidelityTaqbuffer 2.5μL，10mmoL／L dNTPs 1μL，上游引物（20μmol／L）1μL，下游引物（20μmol／L）1μL，cDNA 2μL，Expand High FidelityTaq0.5μL，最后加入ddH2O 補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃5min；94 ℃45s，55 ℃～58℃50s，72 ℃1min～2.5min，共進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃10min。取PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄／表達(dá)載體構(gòu)建 膠回收1.2.3中HA和NA 的PCR 產(chǎn)物，按照pMD18-T 載體試劑盒說明書與T 載體連接并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，對克隆的陽性質(zhì)粒命名為pMD18-T-HA 和pMD18-T-NA。分別對其進(jìn)行BsmBⅠ和BsaⅠ酶切鑒定并測序。

鑒定產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BsaⅠ和BsmBⅠ進(jìn)行酶切后回收，與BsmBⅠ酶切過pHW2000載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞中，加入5mL 培養(yǎng)基振蕩搖菌。取出100μL 菌液涂布于含有氨芐青霉素（50μg／mL）的LB 平板，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h，挑取白色孤立菌落，接種于5mL含有氨芐青霉素（50μg／mL）液體LB培養(yǎng)基，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h，提取各個基因片段重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，每個片段的陽性質(zhì)粒送3個～5個克隆測序。測序正確的質(zhì)粒命名為pHW-HA 和pHW-NA。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄／表達(dá)載體陽性質(zhì)?；钚詼y定 測序鑒定正確的陽性克隆一部分進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，為下一步的轉(zhuǎn)染做準(zhǔn)備，一部分保存于-80 ℃超低溫冰箱。取2μL質(zhì)粒200倍稀釋后，紫外分光光度計測定質(zhì)粒的濃度和純度，含量在100μg／mL以上、OD 260nm／OD 280nm 為1.75～2.00的質(zhì)粒備轉(zhuǎn)染用。

1.2.6 重組病毒的拯救 將293T 細(xì)胞和Vero細(xì)胞按2∶1的細(xì)胞量鋪入6孔板，待細(xì)胞長至70%～90%融合度時用無血清無抗生素的OPTI-MEM培養(yǎng)基洗2 次后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將含H1N1 亞型流感病毒6個基因的陽性質(zhì)粒（pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、 pHW2000-PA、 pHW2000-M、pHW2000-NP和pHW2000-NS）與含H9N2 亞型流感病毒分離株HA、NA 基因的質(zhì)粒pHW-HA 和pHW-NA 按質(zhì)量比1∶1 的比例混合均勻，與轉(zhuǎn)染試劑一起加入到無血清、無抗生素的DMEM 中，按說明書進(jìn)行分散和結(jié)合后均勻覆蓋于細(xì)胞上，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中吸附6h，換入含100mL／L 血清的DMEM 1.0mL，再培養(yǎng)72h，觀察病變，吹落細(xì)胞后與上清一起收集，以除HA 之外的七質(zhì)粒共轉(zhuǎn)為陰性對照。

1.2.7 重組病毒的鑒定 收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞和上清，經(jīng)尿囊腔接種于10dSPF雞胚，每胚0.2mL，每個樣品接種3個胚，置37 ℃孵化箱培養(yǎng)72h，觀察雞胚死亡情況，分別收集尿囊液，用OIE 推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行血凝（HA）試驗，HA 陽性者用H9亞型流感病毒的陽性血清進(jìn)行血凝抑制（HI）試驗。第1 代陰性的取尿囊液再盲傳1代。

HI陽性尿囊液，取其雞胚傳代的第4代尿囊液提取RNA，用RT-PCR方法（同1.2.2和1.2.3）擴(kuò)增獲救病毒NA 和HA 基因，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序；未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的RNA 用通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增對照，以排除尿囊液中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA 的存在。陰性對照的尿囊液同樣進(jìn)行驗證。

將含獲救H9N2 亞型流感病毒的第4 代雞胚尿囊液進(jìn)行10倍遞次稀釋，0.2mL／胚接種于10d SPF雞胚，每個稀釋梯度接種4個雞胚，37 ℃培養(yǎng)，棄掉24h之內(nèi)的死胚，24h之后死亡的雞胚置4℃保存。通過測定感染雞胚尿囊液的血凝活性來判斷其是否感染，用Reed Muench法計算EID50。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲得

以病毒cDNA 為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，取1μL PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果表明成功獲得目的基因（圖1）。

2.2 轉(zhuǎn)錄／表達(dá)載體的構(gòu)建

2.2.1 目的基因與18-T 載體的連接 經(jīng)過藍(lán)白斑篩選挑取白色克隆，經(jīng)鑒定后陽性克隆擴(kuò)增搖菌12h左右，提取質(zhì)粒酶切后進(jìn)行PCR鑒定重組載體，結(jié)果如圖2。將上述陽性的菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與相應(yīng)基因序列完全一致。

2.2.2 目的基因與pHW2000載體的連接轉(zhuǎn)化將HA、NA 兩個目的片段與載體經(jīng)過連接轉(zhuǎn)化后，挑單克隆，用菌落PCR 的方法鑒定陽性克隆，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。將通過菌落PCR鑒定為陽性的菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，并通過DNA Star軟件進(jìn)行序列比對，結(jié)果H9N2亞型流感重組病毒片段序列正確無誤，均符合病毒拯救要求，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 禽流感H9N2亞型山東分離株HA、NA 基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR Products of HA and NA genes of AIV H9N2Shandong strain

圖2 HA 基因和NA 基因連接T 載體擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果Fig.2 The enzyme digestion results of amplification products of HA and NA genes connected with T vector gene

圖3 HA 和NA 基因PCR鑒定結(jié)果Fig.3 RT-PCR products of HA and NA genes

2.2.3 轉(zhuǎn)錄／表達(dá)載體陽性質(zhì)粒濃度和純度測定測序鑒定正確的陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，取2μL質(zhì)粒200倍稀釋后，紫外分光光度計測定質(zhì)粒的濃度和純度，測定結(jié)果見表1。

2.3 重組病毒的拯救

8個重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T／Vero細(xì)胞48h后，收集病毒和細(xì)胞，接種第1代10dSPF 雞胚，72h后收集尿囊液測定血凝效價達(dá)29。用H9亞型陽性血清進(jìn)行重組病毒的血凝抑制試驗，結(jié)果表明，病毒可被H9陽性血清抑制，血凝抑制效價為29。陰性對照轉(zhuǎn)染孔的上清液和293T／Vero細(xì)胞接種雞胚，連續(xù)傳2代，雞胚尿囊液中未檢測到血凝效價。

表1 紫外分光光度計檢測結(jié)果Table 1 The detection results of ultraviolet spectrophotometer

2.4 獲救H9N2亞型流感病毒的RT-PCR及測序鑒定

HI陽性尿囊液，取其雞胚傳代的第4代尿囊液提取RNA，用RT-PCR 方法（同1.2.2和1.2.3）擴(kuò)增獲救H9N2病毒NA 和HA 基因，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序；鑒定結(jié)果表明，獲救病毒的HA 和NA 基因與H9N2山東分離株完全一致。

2.5 獲救病毒雞胚半數(shù)感染劑量（EID50）的測定

參照文獻(xiàn)的方法，將傳至第4代的H9N2亞型重組病毒尿囊液接種于雞胚，觀察雞胚死亡情況，Reed-Muench法可得獲救H9N2 亞型流感病毒雞胚半數(shù)感染劑量（EID50）為10-7.75／0.2mL（表2）。

表2 EID50測定雞胚感染和死亡數(shù)Table 2 Infection（I）and death（D）numbers of chicken embryos in EID50test

3 討論

病毒拯救技術(shù)是在了解病毒復(fù)制特點等基礎(chǔ)上，利用分子生物學(xué)技術(shù)建立和完善起來的，是通過人工操作基因，用病毒核酸的適當(dāng)形式在一定條件下轉(zhuǎn)染細(xì)胞，產(chǎn)生有感染性的病毒粒子［13］。流感病毒的反向遺傳操作技術(shù)雖然已經(jīng)廣泛應(yīng)用于探討流感病毒基因結(jié)構(gòu)與功能、揭示病毒的致病、傳播和免疫機(jī)理、構(gòu)建疫苗候選株等方面的研究，但全病毒拯救還是比較困難，拯救成功的大多是那些高致病性毒株［14］。

在本試驗建立的8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)中，所用雙向轉(zhuǎn)錄／表達(dá)載體pHW2000構(gòu)建和克隆雖然步驟較為繁瑣，但具有比單向載體更高的效率，每個片段連接的效率高達(dá)80%以上。用轉(zhuǎn)染48h后的上清接種雞胚，在第1代均可上升至高效價，經(jīng)4次傳代，和分離株一樣，病毒增殖能穩(wěn)定在一定滴度范圍之內(nèi)。同時通過改變質(zhì)粒濃度來控制起始病毒蛋白的量，從而到達(dá)提高轉(zhuǎn)染效率的目的，以保證轉(zhuǎn)染成功。本試驗中經(jīng)過多次測定，同時結(jié)合文獻(xiàn)報道，采用的質(zhì)粒濃度為200μg／mL，純度（260／280）為1.75～2.0。另外，在轉(zhuǎn)染過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞長滿80%～90%時，共轉(zhuǎn)效果最好。本試驗以H1N1亞型流感病毒的6 個內(nèi)部基因片段為骨架與H9N2 亞型流感病毒的HA 和NA 基因進(jìn)行重組，成功拯救出了與H9N2亞型禽流感病毒具有同樣基因組合方式的重組病毒，經(jīng)測定獲得的重組H9N2亞型流感病毒的血凝效價為29，高于親本株（27）。這可能是因為重組病毒中含有雞胚高適應(yīng)性的H1N1 亞型流感病毒的基因，其作為骨架拯救出的重組病毒可以達(dá)到很高的血凝效價，這保證了足夠的抗原量并降低了成本，重組病毒在雞胚上連續(xù)傳4代，其增殖能與親本株一樣穩(wěn)定在一想的滴度范圍之內(nèi)。具有較高的免疫效果并可以在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定傳代生長，使其可以作為新型疫苗候選株使用，為禽流感的其他基礎(chǔ)性研究及疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。病毒拯救是否成功，關(guān)鍵在于基因的準(zhǔn)確克隆，本試驗在進(jìn)行H9亞型禽流感病毒NA 基因的克隆過程中，非編碼區(qū)的序列突變導(dǎo)致多次克隆失敗，經(jīng)過多次的篩選測定才得到準(zhǔn)確序列，使得下一步的病毒拯救可以順利進(jìn)行。本試驗還對獲救H9N2 亞型流感病毒進(jìn)行了傳代，傳至第4代的獲救H9N2亞型流感病毒的HA 和NA 基因序列仍與分離株一致，說明獲救的病毒穩(wěn)定，保持了其抗原特性。

流感病毒亞型眾多，變異很快，特別2013 年H7N9亞型禽流感病毒的發(fā)現(xiàn)，說明流感病毒已經(jīng)突破了種間屏障［15］。疫苗作為防控流感流行的有效手段，得到了大家的公認(rèn)，但是傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)工藝需要的時間長且步驟繁瑣。反向遺傳學(xué)的發(fā)展一方面簡化了流感疫苗株產(chǎn)生的流程，縮短了疫苗制備所需的時間，減少了疫苗生產(chǎn)的成本，另一方面，反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展也為流感病毒的基礎(chǔ)研究提供了便利［16］。因此，我們有理由相信，反向遺傳學(xué)在流感病毒這個領(lǐng)域中將會得到越來越多的應(yīng)用。

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