謝志勤，謝芝勛，劉加波，龐耀珊，鄧顯文，謝麗基，范 晴，羅思思

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室，廣西南寧530001）

禽肺炎病毒（Avian pneumovirus，APV）是禽偏肺炎病毒屬的成員，屬于禽副黏病毒科［1］，該病毒主要危害火雞。但是近幾年發(fā)現(xiàn)這種病毒也侵害不同品種的雞，包括種雞、商品肉雞和雞蛋，引起這些雞發(fā)病，發(fā)病雞的日齡一般在4周齡～7周齡，5周齡～6 周齡時最易發(fā)生。發(fā)病雞沒有特征性癥狀，主要引起雞的呼吸道癥狀，臨床上與禽流感、雞新城疫、禽傳染性支氣管炎、支原體感染等的癥狀相似，以噴嚏，眼結(jié)膜潮紅，淚腺腫，有時頭部出現(xiàn)皮下水腫；產(chǎn)蛋雞感染該病毒主要引起產(chǎn)蛋下降2%～40%，種蛋孵化率降低；隨著病情的發(fā)展，會出神經(jīng)癥狀；該病引起的發(fā)病率為1%～90%，引起雞死亡率為1%～20%，如繼發(fā)其他感染，引起的死亡率會更高，對養(yǎng)禽業(yè)造成的危害極大［2-4］。

禽肺炎病毒基因組為不分節(jié)段的負鏈RNA，長度約為14kb，禽肺炎病毒編碼有8種蛋白，這8種編碼蛋白依次為N-P-M-F-M2-SH-G-L［5］。在8 種編碼蛋白中，融合蛋白（F）尤為重要，是主要抗原結(jié)構(gòu)蛋白，目前已知的作用是具有抗原性和細胞吸附作用［6］。根據(jù)禽肺炎病毒核苷酸和氨基酸序列可以將其分為A、B、C、D 等4個亞型［7］。A 亞型最早報道發(fā)生于南非和英格蘭；B亞型發(fā)生于匈牙利、西班牙和意大利等歐洲國家；現(xiàn)在A 亞型和B 亞型在世界很多國家都流行；C亞型是1997年從美國火雞中分離的禽肺炎病毒，經(jīng)鑒定其不同于A 亞型和B 亞型［8］，韓國從野雞中分離到1株C亞型禽肺炎病毒［9］；而D 亞型目前僅見報道于法國［5］。

我國哈爾濱獸醫(yī)研究所的沈瑞忠等［10］于1998年首次分離到該病毒，證明該病毒在我國的雞群中存在。Owoade A A 等［11］對我國南方部分地區(qū)雞群進行禽肺炎病毒病原學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A 亞型的禽肺炎病毒陽性檢出率達39%，B 亞型則為陰性。郭龍宗等［12］對我國部分種雞開展禽肺炎病毒血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在種雞中禽肺炎病毒感染也普遍存在。陳琳等［13］應(yīng)用RT-PCR 方法檢測出我國有B亞型禽肺炎病毒存在。

實時熒光定量RT-PCR 是一種融PCR 和DNA探針雜交技術(shù)為一體的基因體外擴增技術(shù)，它通過實時檢測PCR 產(chǎn)物熒光信號的變化而達到檢測病原核酸的目的，該技術(shù)具有操作簡便、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，已成為動物病原檢測的重要方法［14-18］。另外，該技術(shù)還可以根據(jù)建立的標準曲線，直接從檢測到的熒光閾值推算樣品中相應(yīng)病原的含量，在臨床檢測和對疾病進程的評價上具有很高的實用價值。目前，國外檢測禽肺炎病毒主要是通過病毒分離鑒定［19］、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）［20］、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）［21-22］、熒光PCR［23］等，但國內(nèi)還沒有應(yīng)用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR 技術(shù)檢測鑒別禽肺炎病毒的研究報道。本研究采用SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR 技術(shù)，建立了檢測鑒別C亞型禽肺炎病毒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 C 亞型禽肺炎病毒APV／MN-10，由美國濱夕法尼亞大學(xué)Lu教授惠贈；對照菌（毒）株：雞新城疫病毒（La Sota）、禽流感病毒H9（A／chicken／Guangxi／LF／2007，H9N2）、雞傳染性支氣管炎病毒（Mass 41）、雞傳染性喉氣管炎病毒（北京株）、禽腦脊髓炎病毒（AE Van）、雞毒支原體（MG）均由本實驗室保存；禽呼腸病毒（Reo S1133）、禽巴氏桿菌（C48-1）和禽大腸埃希菌（E.coliO2）購自中國獸藥監(jiān)察所；雞馬立克病（MD）疫苗毒，南京梅里亞動物保健品公司提供。

1.1.2 儀器和主要試劑 Lightcycler 2.0熒光定量PCR 儀，羅氏公司（Roche）產(chǎn)品；10 mmol／L dNTPs Mix（產(chǎn)品目錄號：D4030RA）、5×RT buffer（含25mmol／L Mg2＋，產(chǎn)品目錄號：D2620）、反轉(zhuǎn)錄隨機引物（50μmol／μL，產(chǎn)品目錄號：D3802）、AMV反轉(zhuǎn)錄酶（5U／μL，產(chǎn)品目錄號：D2620）、RNA 酶抑制劑（40U／μL，產(chǎn)品目錄號：D2313A）、2×PremixTaqTMmix（產(chǎn)品目錄 號：RR003A，含10μmol／L dNTPs，Mg2＋，5UTaq酶）、2×One step SYBR Prime Script Plus RT-PCR bufferⅣ（產(chǎn)品目錄號：RR096A，內(nèi)含10 mmol／L dNTPs，Mg2＋，SYBR-Green Ⅰ等）、TaKaRa ExTaqHS（產(chǎn)品號：RR096A，5 U／μL）、Preme Script RT Enzyme Mix（產(chǎn)品目錄號：RR096A，內(nèi)含Inhibitor）、2×SYBR Premix ExTaqⅡ（產(chǎn)品號RR820A，內(nèi)含5 U／μL TaKaRa ExTaqHS，10 mmol／L dNTP Mixture，Mg2＋，SYBRGreen Ⅰ等）、PMD-18T，購自寶 生 物生物工程（大連）有限公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收純化試劑盒，購自北京博大泰克生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 SPF 雞胚 SPF 種蛋為北京梅里亞種禽有限公司產(chǎn)品，經(jīng)本研究室孵化至7d。

1.1.4 臨床樣品采集 臨床樣品采自廣西南寧市和玉林市不同地方的5個養(yǎng)雞場，收集有腫頭或呼吸道癥狀的20d～60d肉雞的肺及氣管共54份，保存于-70 ℃。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)基因庫中已發(fā)表的禽肺炎病毒F基因（基因庫中基因序列號，A 亞型No.DM25622，B 亞 型№Y14292，B 亞 型 №Y14293，C 亞型№AF187154），應(yīng)用MegAlign 軟件進行ClustaV Method分析保守序列，然后根據(jù)C亞型禽肺炎病毒F 基因（基因庫中基因序列號№AF187154）保守序列進行設(shè)計，采用Primer Express 2.0軟件，設(shè)計一對用于SYBR GreenⅠ特異性擴增的引物，另設(shè)計一對用于序列測定的引物。設(shè)計的引物序列通過GenBank 進行Blast比對分析，分析的引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，引物序列見表1。

表1 所用引物序列Table 1 The sequences of the primers used in this study

1.2.2 禽肺炎病毒的RT-PCR 擴增

1.2.2.1 禽肺炎病毒的增殖及處理 用滅菌的PBS溶液按1∶100倍稀釋APV／MN 毒株，然后經(jīng)卵黃囊接種7d 的SPF 雞胚，每胚0.2 mL，收集24h～120h死亡雞胚的尿囊液和尿囊膜，尿囊膜經(jīng)研磨后與尿囊液混合，凍融3 次，8 000r／min離心5min，取上清進行RNA提取或保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 臨床樣品的處理 用滅菌的PBS溶液按1∶5將肺及氣管混合進行研磨，-70 ℃凍融3次，8 000r／min離心5min，取上清進行RNA 提取或保存于-70 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 RNA 抽提 參照已報道的方法［24］，對已處理的樣品進行RNA 提取。

1.2.2.4 RT-PCR 擴增 反轉(zhuǎn)錄（RT）采用10μL反應(yīng)體系，5×RT buffer（含10μmol／L dNTPs、Mg2＋）2 μL，Random 9 mer（50μmol／L）0.5μL，反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）0.5μL，RNA inhibitor 0.5μL，模板RNA 2 μL，DEPC水補足10μL，RT 程序為42 ℃60mim，85℃5mim；PCR采用50μL反應(yīng)體系：在PCR反應(yīng)管中分別加入2×PremixTaqTM mix 25μL，cDNA 4 μL，50pmol／μL的APV3、APV4引物各0.5μL，滅菌超純水加至50μL。反應(yīng)程序為：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，共進行35個循環(huán)；72℃10min，4℃終止反應(yīng)。

1.2.3 標準陽性模板的制備 APV RT-PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)15g／L脂糖凝膠電泳，染色后將含有目的片段的凝膠切下，應(yīng)用凝膠回收試劑盒回收并純化目的片段，回收的片段與PMD18-T 載體進行連接，再轉(zhuǎn)染到大腸埃希菌中。提取轉(zhuǎn)染后大腸埃希菌中的質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR 和雙酶切鑒定APV 陽性質(zhì)粒DNA，陽性菌送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進行序列測定和供制作標準曲線用。陽性質(zhì)粒DNA OD 260nm／OD 280nm 值的測定，根據(jù)OD 260nm值計算質(zhì)粒濃度，按公式換算成拷貝數(shù)，拷貝數(shù)＝（濃度×阿伏加德羅常數(shù)）／（一個堿基對的平均分子量×總長度）。

1.2.4 標準曲線的確定和熔解曲線分析 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR 標準曲線的確定，對質(zhì)粒PMD-APV DNA 進行定量，然后按10倍進行稀釋至100～107拷貝數(shù)／μL，將稀釋的拷貝數(shù)作為模板進行SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR 擴增，實時熒光定量PCR 擴增采用2×SYBR Premix ExTaqⅡ試劑盒進行擴增，建立標準曲線；對擴增的標準曲線進行熔解曲線分析，分析擴增的曲線是否為單一的峰。

1.2.5 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR 擴增條件的優(yōu)化 對SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR 擴增的各條件進行優(yōu)化，擴增反應(yīng)體系為20μL，2×One step SYBR PrimeScript Plus RTPCR bufferⅣ10μL，TaKaRa ExTaqHS 0.5μL，Preme Script RT Enzyme Mix 1μL，RNA 模板2 μL，分別加入不同濃度的APV 上游引物和下游引物，RNase Free dH2O 補足20μL；通過優(yōu)化不同的退火溫度建立優(yōu)化的反應(yīng)程序，篩選出能夠檢測APV 且Ct值和擴增效率影響不大的引物濃度以及反應(yīng)程序，建立SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RTPCR 擴增方法。

1.2.6 特異性試驗 用建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR 條件，對APV／MN RNA 以及對照的ND La Sota、AIVH9、IBV Mass41、AEVan、ReoS1133 的RNA 以及MDV、ILTV、PM C48-1、MG、E.coliO2血清型的DNA 進行擴增，檢驗本方法的特異性。

1.2.7 敏感性試驗 測定APV 陽性質(zhì)粒濃度，然后進行10倍系列稀釋至100拷貝數(shù)／μL～107拷貝數(shù)／μL，各稀釋度取1μL作為模板，用建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RT-PCR程序測定本技術(shù)的敏感性。

1.2.8 重復(fù)性試驗 選取2個不同濃度的陽性質(zhì)粒DNA 作為模板，每個模板濃度做2個重復(fù)，然后用建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR 程序進行擴增，計算兩個重復(fù)Ct值的變異系數(shù)，驗證熒光定量PCR 的批內(nèi)重復(fù)性；另選取1個濃度的陽性質(zhì)粒DNA 作為模板，進行熒光定量PCR 擴增，間隔7d重復(fù)一次，共進行3次重復(fù)，然后計算Ct值的變異系數(shù)，驗證熒光定量PCR 的批間重復(fù)性。

1.2.9 臨床樣品的檢測 對保存的54份廣西南寧市和玉林市不同地方5個養(yǎng)雞場收集的頭腫或有呼吸道癥狀的病雞肺和氣管樣品RNA 進行檢測，如有陽性樣品出現(xiàn)，則按1.2.3方法制備陽性菌送深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進行序列測定。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 擴增

用設(shè)計的實時熒光PCR引物進行APV RT-PCR擴增，結(jié)果能擴增出大小為97bp的片段（圖1）。

圖1 禽肺炎病毒RT-PCR 擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR amplification products of avian pneumovirus

2.2 標準曲線的確定和熔解曲線分析

通過對熒光定量PCR 擴增標準曲線條件的優(yōu)化，獲得最佳擴增反應(yīng)條件為：反應(yīng)體系為20μL，2×SYBR Premix ExTaqⅡ10μL，質(zhì)粒PMD-APV DNA 1μL，10pmol／μL APV1和APV2引物各0.4 μL，RNase Free dH2O 補足20μL，然后進行標準曲線的擴增，擴增的程序為：95 ℃15s；95 ℃20s、60 ℃20s，共40個循環(huán)；然后95 ℃0s，20℃／s，65℃20s，20℃／s，95 ℃0s，0.1℃／s進行熔解曲線分析。最后進入40 ℃10s 結(jié)束，標準樣品表現(xiàn)為單一的峰，產(chǎn)物的Tm 值均一。通過熔解曲線分析，其擴增只出現(xiàn)單一的峰（圖2和圖3）。

2.3 SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR的優(yōu)化

通過SYBR GreenⅠ實時熒光定量RT-PCR擴增條件的優(yōu)化，獲得最佳的反應(yīng)條件為：2×One step SYBR PrimeScript Plus RT-PCR buffer 10μL，TaKaRa ExTaqHS 0.5μL，PremeScript RT Enzyme Mix 1μL，10pmol／L 濃度的APV1和APV2引物各0.4μL，終濃度各為0.2pmol／L，模板2.0μL，滅菌超純水補足20μL。反轉(zhuǎn)錄程序：42℃15min，95 ℃2min；PCR 程序：95 ℃15s，60 ℃20s，40個循環(huán)；最后以40 ℃10s結(jié)束。樣品表現(xiàn)為單一的峰，產(chǎn)物的Tm 值均一。

圖2 在530nm 吸光度下SYBR Green Ⅰ實時熒光RT-PCR標準曲線圖Fig.2 The standard curve of SYBR Green Ⅰreal-time RT-PCR at 530nm

圖3 在530nm 吸光度下SYBR Green Ⅰ實時熒光RT-PCR熔解曲線圖Fig.3 The melting curves of SYBR Green Ⅰreal-time RT-PCR at 530nm

2.4 特異性試驗

用優(yōu)化的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量RTPCR反應(yīng)條件對參試病原株的核酸進行特異性反應(yīng)檢測，檢測結(jié)果顯示在530nm 吸光度下，只有APV毒株的核酸出現(xiàn)特異的曲線，為陽性，其他對照病原株的核酸均沒有曲線出現(xiàn)，為陰性（圖4）。

2.5 敏感性試驗

用優(yōu)化的SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR反應(yīng)條件對10倍稀釋至100拷貝數(shù)／μL～107拷貝數(shù)／μL 的各稀釋度進行敏感性檢測，同時也進行PCR檢測，檢測結(jié)果顯示，本研究建立的SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR反應(yīng)最低檢出限量為10個拷貝的APV，常規(guī)PCR 為100個拷貝，結(jié)果見圖5和圖6。

2.6 重復(fù)性試驗

選取1.0×104拷貝／μL 和1.0×102拷貝／μL 2個濃度的陽性質(zhì)粒作重復(fù)試驗，其所得的Ct值分別為15.75、15.88和19.03、19.29，其Ct值變異系數(shù)均小于5%；選取1.0×104／μL 的陽性質(zhì)粒，每間隔7天共3次進行SYBR GreenⅠ實時熒光PCR 測定，其Ct值的變異系數(shù)也小于5%。其重復(fù)性好，結(jié)果見圖7。

圖4 在530nm 吸光度下SYBR Green Ⅰ實時熒光RT-PCR特異性試驗結(jié)果Fig.4 The specificity test results of SYBR Green Ⅰreal-time RT-PCR at 530nm

圖5 在530nm 吸光度下SYBR Green Ⅰ實時熒光RT-PCR敏感性試驗結(jié)果Fig.5 The sensitivity test results of SYBR Green Ⅰreal-time RT-PCR at 530nm

圖6 禽肺炎病毒RT-PCR敏感性試驗電泳結(jié)果Fig.6 Electrophoresis of sensitivity RT-PCR amplification products of avian pneumovirus

圖7 SYBR Green Ⅰ實時熒光RT-PCR重復(fù)性試驗結(jié)果Fig.7 Repeatability test results of SYBR GreenⅠreal-time RT-PCR

2.7 臨床樣品的檢測

對保存的廣西不同地方養(yǎng)雞場收集的頭腫或有呼吸道癥狀的病雞肺和氣管組織樣品RNA 進行檢測，結(jié)果52份樣品中沒有APV 陽性的樣品。

3 討論

近幾年來，在商品肉雞中出現(xiàn)腫頭和上呼吸道癥狀的現(xiàn)象日漸增多，蛋雞產(chǎn)蛋下降也時有發(fā)生，引起這些癥狀的病原有多種，其中由禽肺炎病毒引起的癥狀與雞新城疫病、禽流感等病原引起的癥狀很相似，根據(jù)臨床癥狀很難作出正確的判斷，必須通過實驗室方法進行檢測區(qū)分。目前常規(guī)檢測禽肺炎病毒的方法耗時較長，工作繁瑣，不利于病毒的快速檢測，而本試驗建立的方法，要比RT-PCR檢測方法更節(jié)省時間，無需電泳即可以分析出結(jié)果，可以滿足臨床快速、準確地診斷禽肺炎病毒的需要。

實時熒光定量PCR 技術(shù)在禽病的診斷中已有很多應(yīng)用［21-23］，它不僅可以對檢測的樣品做出準確、快速的診斷，還可以對檢測樣品進行定量分析，而SYBR Green Ⅰ實時熒光RT-PCR檢測方法，是利用SYBR Green Ⅰ染料實時對PCR 擴增時產(chǎn)生的DNA 雙鏈進行檢測。在建立本方法時，首先要排除引物二聚體的產(chǎn)生而造成的干擾，通過優(yōu)化引物濃度、反應(yīng)介質(zhì)和反應(yīng)條件來降低引物二聚體的產(chǎn)生。本試驗從熔解曲線分析結(jié)果可以知道，引物的終濃度為0.2pmol／μL 時，擴增的熔解曲線只有單一的峰出現(xiàn)，表明本試驗建立的方法沒有二聚體的產(chǎn)生，所擴增出現(xiàn)的曲線均為陽性曲線。

本研究建立的方法經(jīng)特異性、敏感性和重復(fù)性試驗，特異性結(jié)果只有禽肺炎病毒擴增出現(xiàn)陽性曲線，而其他參試病原株檢則沒有陽性擴增曲線出現(xiàn)，說明本試驗建立的方法特異性好。敏感性試驗可以檢測到10拷貝的禽肺炎病毒質(zhì)粒DNA，檢測禽肺炎病毒敏感。重復(fù)試驗的Ct值變異系數(shù)均小于5%，說明其重復(fù)性較好。因此，本研究建立的方法可以用于禽肺炎病毒的檢測，為鑒別診斷由禽肺炎病毒引起的疾病提供了快速、準確有效的方法。

我國于1998年在雞群中分離到禽肺炎病毒，到2012年證實我國存在有A 亞型和B 亞型禽肺炎病毒，且已證實這兩種亞型在雞群中普遍存在，對我國養(yǎng)雞業(yè)造成了很大的危害。我國是養(yǎng)禽大國，目前我國還沒見對C 亞型禽肺炎病毒開展調(diào)查的報道。應(yīng)用本試驗建立的方法，對保存的來自廣西不同地方的臨床樣品進行檢測，結(jié)果沒有檢測到C 亞型禽肺炎病毒陽性樣品。這一結(jié)果說明檢測的雞群中沒有C亞型禽肺炎病毒存在。由于本試驗采集的臨床樣品數(shù)量、品種有限，如要獲得更準確的檢測結(jié)果，需要進行更大范圍樣品的檢測調(diào)查。

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