鄒爭志，聶培培，倪藝榕，周小明*

(1.華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)研究所，暨激光生命科學(xué)教育部重點實驗室，廣東 廣州 510631;2.廣州金城醫(yī)學(xué)檢驗有限公司，廣東 廣州 510631)

硫鏈絲菌素(Thiostrepton)，又稱作硫鏈絲菌肽，是一種提取自鏈霉菌的天然抗生素，屬于噻唑類抗生素，具有廣譜的抗革蘭氏陰性與陽性細(xì)菌的作用，在獸醫(yī)中常作為抗乳腺炎藥物使用。2008年，首次作為癌基因FoxM1抑制劑及蛋白酶體抑制劑在乳腺癌中的研究而備受關(guān)注［1］。近幾年，Thiostrepton作為一種抗腫瘤的新藥受到廣泛研究，發(fā)現(xiàn)Thiostrepton主要通過抑制FoxM1的表達(dá)及抑制蛋白酶體活性，表現(xiàn)出在體內(nèi)外均具有顯著的抗腫瘤作用［2］。最近研究表明Thiostrepton通過靶向FoxM1蛋白及蛋白酶體而誘導(dǎo)乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡，在應(yīng)用于腫瘤的治療中具有潛在的價值［3-7］。在乳腺癌中的研究報導(dǎo)，Thiostrepton除了通過靶向FoxM1蛋白抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖活性［3］，最近發(fā)現(xiàn)它能增強耐順鉑的乳腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性［8］，與蛋白酶抑制劑Bortezomib聯(lián)合作用于三陰乳腺癌細(xì)胞具有顯著的協(xié)同效應(yīng)［9］。在其他腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，Thiostrepton對黑色素瘤細(xì)胞有顯著的抗腫瘤活性，而對良性的黑色素細(xì)胞抑制作用不明顯［10］。在B細(xì)胞淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Thiostrepton通過靶向FoxM1誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤的凋亡并抑制其轉(zhuǎn)移［11］。在間皮瘤中，Thiostrepton通過靶向Peroxiredoxin 3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［12］。

自噬(autophagy)是溶酶體對細(xì)胞內(nèi)的部分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器等進(jìn)行一系列降解過程的統(tǒng)稱。形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量包裹著胞質(zhì)和細(xì)胞器的具有雙層膜的吞噬泡。自噬在腫瘤細(xì)胞凋亡中具有雙重的作用。近年來越來越多的研究表明，細(xì)胞自噬與細(xì)胞死亡的關(guān)系取決于細(xì)胞類型及細(xì)胞所處的環(huán)境。自噬即可以通過促進(jìn)凋亡而促進(jìn)細(xì)胞死亡，又可以不通過凋亡而直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其中不經(jīng)過凋亡直接誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡習(xí)慣上被稱作自噬性程序性細(xì)胞死亡，也叫Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡［13］。在能量和營養(yǎng)缺乏等條件下，細(xì)胞通過自噬降解胞內(nèi)多余的蛋白質(zhì)而為細(xì)胞提供營養(yǎng)和能量以拯救細(xì)胞。由于自噬與細(xì)胞死亡之間存在著聯(lián)系，許多學(xué)者開始把自噬作為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的靶點進(jìn)行研究。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Thiostrepton顯著抑制了非小細(xì)胞肺癌PC-9細(xì)胞的活力。利用熒光顯微鏡和免疫印跡技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)Thiostrepton同時也誘導(dǎo)了PC-9細(xì)胞自噬的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Thiostrepton誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞的自噬被抑制時，細(xì)胞的死亡明顯減少。

1 材料與方法

1.1 材料

Thiostrepton、MTT、3-甲基腺嘌呤 (3-Methyladenine，3-MA)、DMSO 購買于 Sigma公司。LC3、p62和GAPDH抗體購買于Cell Signalling Technology公司。凋亡檢測試劑盒購買于Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC-9(購于中科院上海細(xì)胞庫)，培養(yǎng)在明膠鋪底的塑料培養(yǎng)瓶，采用含10%胎牛血清(hyclone)的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 自噬特異性抑制實驗

細(xì)胞接種到六孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，3-MA用PBS溶解，儲存濃度為100 mmol/L，其冷卻時有沉淀，使用前加熱使之溶解。3-MA聯(lián)合Thiostrepton處理組，3-MA在加Thiostrepton處理前預(yù)處理1 h，使3-MA終濃度為5 mmol/L，再與Thiostrepton共同作用不同時間，3-MA處理組只加3-MA(終濃度5 mmol/L)，相應(yīng)體積的DMSO處理組作為空白對照組。

1.4 免疫印跡

將實驗處理過的細(xì)胞用胰酶消化收集，用預(yù)冷的PBS洗三遍，加入適量含蛋白酶抑制劑的裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1 mmol/L Na3VO4，100 mmol/L PMSF)在冰上裂解30 min，離心，收集上清蛋白液。采用10%-15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂奶粉液封閉，之后分別孵育一抗和二抗。ECL發(fā)光顯色。

2 結(jié)果

2.1 Thiostrepton抑制PC-9細(xì)胞活力

本研究中，我們選取了 0、1、2、4、8 μmol/L 的Thiostrepton作用于肺癌細(xì)胞PC-9，在分別作用細(xì)胞24和48 h后，完成MTT實驗，結(jié)果表明(圖1所示)，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的活力顯著降低。在24 h，與對照組比較，1、2、4、8 μmol/L 的 Thiostrepton處理組細(xì)胞平均生長抑制率分別為13.9%、25.9%、40.2%、50.5%。在 48 h，與對照組比較，1、2、4、8 μmol/L的Thiostrepton處理組細(xì)胞平均生長抑制率分別為 23.8%、35.4%、62.7%、70.6%。上述結(jié)果表明，隨著Thiostrepton濃度的增加，PC-9細(xì)胞的活力被抑制的越明顯，表明Thiostrepton對PC-9細(xì)胞的抑制具有劑量依賴性。并且我們也發(fā)現(xiàn)在同一濃度下，48 h細(xì)胞的抑制率顯著高于24 h，表明Thiostrepton抑制PC-9細(xì)胞的活力具有時間依賴性。

2.2 Thiostrepton誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞自噬

在PC-9細(xì)胞被Thiostrepton作用后，通過在高倍顯微鏡下觀察，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有小泡的出現(xiàn)，因此這提示我們可能Thiostrepton能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。因而我們檢測了自噬標(biāo)志蛋白LC3I/II和p62去驗證是否Thiostrepton能夠誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞發(fā)生自噬。我們選取了 4 個濃度，分別是 0、2、4、8 μmol/L的Thiostrepton作用于肺癌細(xì)胞PC-9，在作用細(xì)胞48 h后，提取總蛋白，完成免疫印跡實驗，結(jié)果表明(圖2A所示)，隨著藥物濃度的增加，LC3II的表達(dá)顯著升高，而p62隨著濃度的升高而顯著降低。通過對三次獨立的實驗，做會灰度比分析也表明隨著Thiostrepton濃度的增加，LC3II的表達(dá)依次上升(圖2B)，而p62的表達(dá)依次遞減(圖2C)。這結(jié)果說明Thiostrepton誘導(dǎo)了PC-9細(xì)胞自噬的發(fā)生。

圖1 Thiostrepton抑制PC-9細(xì)胞活力Fig.1 Thiostrepton decreased cell viability in PC-9 cells

圖2 Thiostrepton誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞自噬Fig.2 Thiostrepton induced autophagy in PC-9 cells

2.3 抑制Thiostrepton誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬減少細(xì)胞凋亡

在已有的報導(dǎo)中，自噬與細(xì)胞死亡關(guān)系密切，在一些情況下，自噬作用可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存和維持其活力;另外一些情況下，自噬卻能促進(jìn)細(xì)胞死亡。因此，在本研究中我們想知道Thiostrepton誘導(dǎo)的自噬是否與細(xì)胞死亡相關(guān)。接下來，我們通過用自噬抑制劑3-MA抑制Thiostrepton誘導(dǎo)的自噬，然后檢測Thiostrepton誘導(dǎo)的PC-9細(xì)胞的活力的變化。通過MTT實驗，我們發(fā)現(xiàn)在 PC-9細(xì)胞中，當(dāng)Thio-strepton的濃度達(dá)到4μmol/L和8μmol/L 時，5μmol/L的3-MA能夠顯著增強細(xì)胞的活力(圖3A和B所示)。且無論是作用24 h還是48 h，5 μmol/L的3-MA都能夠部分恢復(fù)Thiostrepton抑制的細(xì)胞活力。接下來，我們通過 PI/Annexin-V實驗檢測了Thiostrepton的濃度在4μmol/L和 8 μmol/L 時，5μmol/L的3-MA對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果如圖3C和D所示，PC-9細(xì)胞在4 μmol/L的Thiostrepton作用48 h細(xì)胞的平均凋亡率為24.7%，而當(dāng)4 μmol/L的Thiostrepton作用前1 h同時加 5 μmol/L的3-MA，然后兩藥同時作用PC-9細(xì)胞48 h，此時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的平均凋亡率為 9.2%(圖 3C所示)。在8μmol/L的Thiostrepton作用48 h細(xì)胞的平均凋亡率為37%，8 μmol/L的 Thiostrepton 聯(lián)合 5 μmol/L 的 3-MA 時，細(xì)胞的平均凋亡率顯著減少，降低至15.2%(圖3D所示)。以上結(jié)果表明，3-MA通過抑制Thiostrepton誘導(dǎo)的PC-9細(xì)胞凋亡。同時這也提示Thiostrepton誘導(dǎo)了非小細(xì)胞肺癌自噬性死亡。

圖3 抑制Thiostrepton誘導(dǎo)的自噬減少細(xì)胞凋亡Fig.3 Inhibition of autophagy attenuated cell apoptosis induced by thiostrepton in PC-9 cells

3 討論

目前，臨床常規(guī)的化療藥物在癌癥的治療方面毒副作用很大，病人常不能耐受。因此尋找新的藥物用于腫瘤的治療是目前亟待解決的問題。新近研究發(fā)現(xiàn)Thiostrepton在腫瘤治療中有潛在應(yīng)用價值。本研究探討了Thiostrepton在非小細(xì)胞肺癌中的治療效果，發(fā)現(xiàn)Thiostrepton能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的活力，并且誘導(dǎo)其凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Thiostrepton能夠誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌自噬。而關(guān)于Thiostrepton誘導(dǎo)自噬的分子機制目前尚未見報道。有報道表明，Thiostrepton能夠抑制 FoxM1的表達(dá)，而FoxM1是一個癌基因，其在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用，且FoxM1主要是作為轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)而發(fā)揮其功能。因此有可能Thiostrepton誘導(dǎo)的自噬涉及到抑制FoxM1的表達(dá)而調(diào)節(jié)一些自噬基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

鑒于自噬維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，及其在細(xì)胞死亡中的作用。我們研究了自噬在Thiostrepton誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用。通過用自噬抑制劑3-MA抑制自噬后，發(fā)現(xiàn)Thiostrepton誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯著減少。表明Thiostrepton可能通過誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬性死亡，但其中的具體分子機制需要進(jìn)一步在證據(jù)闡明。

另外，我們發(fā)現(xiàn)在Thiostrepton低濃度時，3-MA恢復(fù)Thiostrepton抑制細(xì)胞活力的效果并不明顯。這可能的原因是低濃度Thiostrepton誘導(dǎo)的自噬并不明顯，所以自噬起的促進(jìn)細(xì)胞死亡的作用也不顯著，因此此時抑制自噬不能顯著增強細(xì)胞活力。并且3-MA主要通過抑制III性PI3K抑制自噬，而它同時也具有抑制I型PI3K的特性，而I型PI3K在促進(jìn)細(xì)胞生長與增殖中起了重要作用，因此在Thiostrepton低濃度的誘導(dǎo)的低水平自噬下，3-MA可能主要是抑制了I型PI3K而抑制了細(xì)胞活力從而增強了Thiostrepton抑制細(xì)胞活力的效果。

總之我們的結(jié)果表明，硫鏈絲菌素促進(jìn)了人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的自噬性死亡，提示硫鏈絲菌素聯(lián)合自噬誘導(dǎo)劑可能在臨床上對治療人非小細(xì)胞肺癌有效。

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