姚 閃，陳 松，葉 茂*

(1.湖南大學(xué)生物學(xué)院分子科學(xué)與分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410082;2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙 410006)

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system，UPS)是細(xì)胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)降解的主要途徑，蛋白質(zhì)在接受泛素化信號(hào)如磷酸化、損傷等后，在一系列泛素化酶(泛素激活酶E1，泛素結(jié)合酶E2，泛素連接酶E3)的作用下，靶蛋白被泛素鏈標(biāo)記，隨后被運(yùn)輸?shù)降鞍酌阁w降解，泛素被釋放重新利用。細(xì)胞通過這種高度特異性的方式對(duì)不需要的蛋白進(jìn)行降解［1］。近年來研究表明，泛素化是一個(gè)可逆的過程，去泛素化酶能夠水解泛素和蛋白質(zhì)間的硫酯鍵，移除泛素分子，逆轉(zhuǎn)泛素化過程，保護(hù)底物不被蛋白酶體水解或者調(diào)控底物的亞細(xì)胞定位和活化。人類基因組至少編碼98種去泛素化酶，這些去泛素化酶根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)的相似性可以被分為六大家族，分別是:泛素特異性蛋白酶家族(Ubiquitin-specific proteaases，USPs)，泛素C末端水解酶家族(Ubiquitin carboxy-terminal hydrolases，UCHs)，卵巢瘤蛋白酶家族(Ovarian-tumor proteases，OTUs)，Machado-Joseph disease protein domain proteases家族(MJDs)，JAMM/MPN結(jié)構(gòu)域相關(guān)的金屬肽酶家族(JAMM/MPN domain-associated metallopeptidases，JAMMs)和單細(xì)胞趨化蛋白誘導(dǎo)蛋白家族(Monocyte chemotactic protein-induced protein，MCPIP)［2］。其中泛素特異性蛋白酶(USPs)是迄今最大的去泛素化酶(Deubiquitinases，DUBs)家族，包含成員超過50個(gè)。

Ubiquitin-specific protease7(USP7)屬于半胱氨酸蛋白酶，是泛素特異性蛋白酶家族的重要成員之一。USP7作為目前研究最為廣泛的一個(gè)泛素特異性蛋白酶，最初是被認(rèn)為是與單純皰疹病毒ICP0蛋白(Herpes simplex viral protein infected cell protein 0)相關(guān)的分子，因此也被稱為Herpes virus-associated ubiquitin-specific protease，HAUSP［3］。近年來研究表明USP7能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)眾多蛋白底物的活性和功能，包括抑瘤蛋白、DNA修復(fù)蛋白、免疫應(yīng)答蛋白、病毒蛋白、表觀遺傳調(diào)節(jié)子等，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［4，5］。

1 USP7的分子結(jié)構(gòu)

人USP7基因位于16號(hào)染色體短臂1區(qū)3帶2亞帶，全長4013 bp，包含31個(gè)外顯子。USP7蛋白含1102個(gè)氨基酸殘基，分子量135 kDa，主要定位在細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)中也有少量的分布。USP7在哺乳動(dòng)物中是一種非常保守的蛋白，人和小鼠以及大鼠的氨基酸序列有98.6%的一致性。USP7蛋白包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域:一個(gè)N末端(N terminal domain，NTD)，一個(gè)酶催化活性中心(aa208-560)和兩個(gè)C末端蛋白酶抵抗結(jié)構(gòu)域(C terminal domain，CTD)，NTD和CTD是USP7與其它蛋白結(jié)合的重要部位［6］。

USP7蛋白分子結(jié)構(gòu)示意圖，the schematic molecular structrue of USP7

USP7通過 NTD aa1-208結(jié)合 TSPYL5、p53、HDM2、HDMX 和 EBNA1［7-9］，也能通過 CTD aa801-1150結(jié)合p53和HDM2，而ICP0蛋白通過aa620-626與 USP7 的 CTD aa622-801 結(jié)合［12，13］。對(duì)比 EBNA1和p53結(jié)合USP7前后的核磁共振頻率變化，發(fā)現(xiàn)EBNA1與USP7有更大范圍的結(jié)合［7］，且EBNA1與USP7的親和力要比 p53與USP7的親和力高出10倍［10］，因此，EBNA1 能在體內(nèi)和體外干擾 p53 與USP7 的相互結(jié)合和 p53 的穩(wěn)定性［11，14，15］。

2007 年，Amaury［16］通過區(qū)段缺失的方法對(duì)USP7的生化特征進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)USP7 NTD缺失體(NTD-USP7)和全長USP7(FL-USP7)酶活相差不大，CTD-/NTD-USP7與CTD-USP7酶活相差也不大，但比FL-USP7的酶活卻降低超過一百倍，由此可知NTD對(duì)USP7的酶活性幾乎沒有影響，CTD對(duì)USP7的酶活影響則較大。通過構(gòu)建USP7的不同缺失突變體發(fā)現(xiàn)，只有TRAF樣區(qū)域aa70-205能成功定位到細(xì)胞核中［16］。生物信息學(xué)分析表明USP7蛋白分子上并沒有核定位序列，推測USP7的入核可能還需要其他分子的協(xié)助，而協(xié)助其入核的分子目前還不清楚。

2 USP7的功能

2.1 細(xì)胞存活

近來發(fā)現(xiàn)USP7與幾種重要的存活相關(guān)的調(diào)控蛋白相關(guān)，分別是 DNMT1、RAE1、Bub3 和 Nup98，它們的穩(wěn)定性和功能都潛在地受到USP7的調(diào)控［17-19］。DNMT1(DNA methyltransferase 1，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1)，是人體內(nèi)最早發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶，在多種腫瘤中高表達(dá)。大量研究表明，其與許多抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的過度甲基化直接相關(guān)。在體內(nèi)，Dnmt1能與USP7和UHRF1形成一個(gè)三元復(fù)合物，結(jié)合到染色質(zhì)上，調(diào)節(jié)DNA的甲基化［20］。在Dnmt1-USP7-UHRF1三元復(fù)合物中，USP7對(duì)Dnmt1的調(diào)控主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面:第一靶向并去泛素化UHRF1，調(diào)控UHRF1的泛素化和穩(wěn)定性，進(jìn)而影響Dnmt1;第二，直接刺激Dnmt1的DNA甲基化活性［20-22］。在體外，USP7也能顯著刺激Dnmt1的DNA甲基化酶活性的維持和全新甲基化的酶活性［23］。

FOXO是FOX基因(即Forkhead)家族中的一個(gè)亞族，人類有4個(gè)FOXO同源基因，正常情況下抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HDM2介導(dǎo)FOXO4的單泛素化，而USP7又可以去泛素化并穩(wěn)定HDM2，并進(jìn)一步促進(jìn)FOXO4的單泛素化，導(dǎo)致FOXO4的核輸入，激活其下游信號(hào)通路，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而影響細(xì)胞的存活［24，25］。

2.2 細(xì)胞周期調(diào)控

細(xì)胞周期是連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)過程，包含G1期、S期、G2期、M期四個(gè)階段。UHRF1(泛素樣，帶有PHD和RING指環(huán)結(jié)構(gòu)域1，也被稱為Np95和ECBP90)通過結(jié)合半甲基化的CpG島，并招募DNMT1在DNA復(fù)制過程中確保DNA甲基化的忠實(shí)傳遞［26，27］。它的缺失與細(xì)胞周期G1期和G2/M期的失調(diào)有關(guān)［28］。USP7能通過與UHRF1相互作用并介導(dǎo)其穩(wěn)定，參與對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控［22］。通過質(zhì)譜分析和特異性的抗體檢測發(fā)現(xiàn)在有絲分裂細(xì)胞M期，特異性激酶CDK1-cyclin B能使UHRF1與USP7相互作用的絲氨酸(S)652位點(diǎn)發(fā)生了磷酸化，顯著抑制UHRF1與USP7的相互作用，導(dǎo)致UHRF1的穩(wěn)定性降低，這與UHRF1在細(xì)胞周期M期活性降低密切相關(guān)。基于以上實(shí)驗(yàn)證據(jù)，研究人員提出了一個(gè)模型:即在G1和S期，USP7與UHRF1相互作用并穩(wěn)定UHRF1，而一旦進(jìn)入M期，活化的CDK1-cyclin-B磷酸化UHRF1的S652，抑制了其與USP7的結(jié)合能力，導(dǎo)致UHRF1隨后被蛋白酶體降解，從而促進(jìn)細(xì)胞周期的運(yùn)行［22］。

2.3 染色質(zhì)重組

核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，由一個(gè)組蛋白八聚體(H2A、H2B、H3、H4)及圍繞在其周圍的一段147 bp的DNA構(gòu)成。組蛋白的翻譯后修飾包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和糖基化等，改變?nèi)旧|(zhì)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，影響基因轉(zhuǎn)錄和基因抑制，而這兩個(gè)過程在癌癥中通常是異常的。目前研究表明，至少有 7 種 DUBs(USP3、USP7、USP16、USP21、USP22、MYSM1和BRCC36)可以結(jié)合并去泛素化組蛋白，主要是H2A和H2B［29-32］。USP7可以直接結(jié)合并去泛素化組蛋白H2A參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控，同時(shí)，USP7還可以通過間接調(diào)控H2B的E3連接酶HDM2來進(jìn)一步調(diào)控 H2B［33，34］。研究發(fā)現(xiàn) USP7在體外可以去泛素化單泛素的H2B［35-37］。然而隨后研究表明在人類纖維原細(xì)胞中抑制或過表達(dá)USP7并不能改變H2B和H2A的總體泛素化水平，但在Hela細(xì)胞中抑制USP7表達(dá)后，H2B的泛素化水平則表現(xiàn)出持續(xù)的上升［38］。USP7活性的細(xì)胞類型差異可能源于鳥苷酸合成酶(GMPS)的存在與否，GMPS被認(rèn)為是 USP7的催化輔因子［36-38］。GMPS結(jié)合到 USP7上后能引起USP7構(gòu)型發(fā)生改變，增強(qiáng)USP7的催化活性［36］。與非轉(zhuǎn)化、無增生的細(xì)胞相比，GMPS在致瘤的和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中是過表達(dá)的［38-40］。

2.4 信號(hào)通路

2.4.1 p53-HDM2 通路 p53 是一種抑瘤蛋白，在保持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，在超過50%的腫瘤中均有突變［41］。E3泛素連接酶HDM2是參與p53泛素化修飾，負(fù)調(diào)控p53的最重要的分子之一，通過將多泛素鏈裝配到p53上，使p53能被識(shí)別而通過蛋白酶體途徑降解，而當(dāng)HDM2單泛素化p53時(shí)，能誘導(dǎo)p53的核輸出。同時(shí)，HDM2也是p53轉(zhuǎn)錄因子的靶分子，其轉(zhuǎn)錄水平受到p53的直接調(diào)控，形成p53-HDM2自反饋環(huán)通路。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn) USP2、USP4、USP5、USP7、USP10 和 USP29 都能參與對(duì)p53的調(diào)控［42-47］。其中，USP7通過調(diào)控HDM2和p53兩者的穩(wěn)定性，而參與到p53-HDM2通路的動(dòng)態(tài)調(diào)控過程中［48，49］。USP7是第一個(gè)被確認(rèn)的 p53的底物特異性去泛素化蛋白酶，USP7在體內(nèi)和體外都能直接結(jié)合p53并去泛素化p53。過表達(dá)USP7能穩(wěn)定p53，促進(jìn)p53依賴的的凋亡和細(xì)胞生長停滯，抑制細(xì)胞的增殖。然而，令人不可思議的是在敲除USP7的細(xì)胞中并非如預(yù)料的一樣，通過增加p53的泛素化而下調(diào)p53，USP7的缺乏反而通過p53的泛素化導(dǎo)致p53的積累。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，USP7不僅是p53的去泛素化酶，而且還能結(jié)合和去泛素化p53的負(fù)調(diào)控子HDM2。結(jié)構(gòu)和生化研究揭示p53和HDM2相互排斥地競爭性結(jié)合USP7 N端TRAF樣的結(jié)構(gòu)域中同一位點(diǎn)，但是USP7結(jié)合HDM2的親和力明顯高于p53數(shù)倍，這提示在正常細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)條件下，HDM2很可能是USP7優(yōu)先結(jié)合的底物，而一旦DNA發(fā)生損傷，ATM介導(dǎo)HDM2發(fā)生磷酸化，降低它與USP7的親和力，從而減弱它的穩(wěn)定性，導(dǎo)致應(yīng)激誘導(dǎo)的HDM2降解，釋放出游離的USP7，因此，在應(yīng)激條件下，p53轉(zhuǎn)變?yōu)閁SP7主要的底物，并被迅速穩(wěn)定。最近的研究發(fā)現(xiàn)，USP7不僅能分別結(jié)合p53和Mdm2形成二元復(fù)合物，而且還存在p53-HDM2-USP7的三元復(fù)合物，USP7不僅能直接結(jié)合并去泛素化Mdm2，而且還能以Mdm2作為橋梁，以in trans的方式去泛素化 p53，導(dǎo)致 p53和 Mdm2的穩(wěn)定［50-52］。

2.4.2 NF-κB 通路 轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB(nuclear factor-κB)是一類普遍存在的、控制著各種基因轉(zhuǎn)錄的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體與其抑制蛋白 I-κB結(jié)合，NLS被覆蓋，NFκB以無活性的三體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。在外界的刺激下，首先引起NF-κB誘導(dǎo)激酶(NFκB inducing kinase，NIK)的活化，繼而激活I(lǐng)κB 激酶(IκB kinase，IKK)，使IκB-α與含72個(gè)氨基酸的泛素蛋白相連，加快IκB-α 的降解速度，迅速降解的 IκB 使結(jié)合體中NFκB的NLS暴露，經(jīng)核孔進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與特定的DNA序列(κB序列)結(jié)合，發(fā)揮其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用［53-56］。研究發(fā)現(xiàn) USP7能結(jié)合在 NF-κB靶基因的啟動(dòng)子上，通過直接去泛素化 NF-κB，逆轉(zhuǎn) NF-κB泛素化及蛋白酶體降解過程，促進(jìn)NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)［57，58］。USP7 缺失后，NF-κB 泛素 化水平升高，轉(zhuǎn)錄活性降低，靶基因表達(dá)水平下調(diào)，因此，USP7對(duì)NF-κB的去泛素化作用在其靶基因的表達(dá)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［57］。

3 與USP7有關(guān)的疾病

3.1 單純性皰疹

單純性皰疹是由單純皰疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)引起的一種傳染病。HSV是一種雙鏈DNA病毒，基因組152 kb，按表達(dá)時(shí)序分為α，β，r 3類，分別表達(dá)立即早期(Immediate-early，IE)基因、早期(Early，E)基因、晚期(Late，L)基因［59］。病毒IE基因編碼的蛋白包括:ICP0，ICP4，ICP22，ICP27和ICP44，它們對(duì)激活后續(xù)E和L基因表達(dá)有重要作用［60］。感染性細(xì)胞多肽 0(Infected cell protein0，ICP0)是一種多功能調(diào)控蛋白，它具有E3泛素連接酶的活性，不僅可調(diào)控病毒基因組的表達(dá)，激活病毒后期基因的轉(zhuǎn)錄，還可以與宿主細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白相互作用，激活細(xì)胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄并且可以調(diào)控裂解性與潛伏性之間的平衡，對(duì)HSV-1的存活至關(guān)重要［31，61］。

USP7能夠與ICP0結(jié)合，并且USP7主要通過兩種方式影響ICP0:第一，USP7直接與 ICP0結(jié)合［46］，ICP0介導(dǎo)USP7的泛素化，促進(jìn)USP7的蛋白酶體降解［46］。同時(shí)，USP7又可以去泛素化 ICP0，保護(hù) ICP0不進(jìn)行自身泛素化并降解［62］。這兩個(gè)反應(yīng)的終結(jié)果是，USP7對(duì)ICP0的去泛素化作用占主要，即USP7穩(wěn)定ICP0;第二，ICP0的表達(dá)會(huì)引起USP7從細(xì)胞核輸出到細(xì)胞質(zhì)，USP7在細(xì)胞質(zhì)與NF-κB和JNK途徑上的TRAF6和IKKγ結(jié)合并去泛素化，從而終止TLR(Toll like receptor，TLR)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［32，33］。USP7通過這兩種方式促進(jìn)了HSV-1病毒在宿主細(xì)胞中的存活，增大了單純性皰疹的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 鼻咽癌

Epstein-Bar virus(EBV)是一種γ皰疹病毒，在全球范圍內(nèi)，有90%以上的人感染過EBV。EBV的潛伏感染能夠誘導(dǎo)鼻咽癌發(fā)生［63］。Epstein-Barr nuclear antigen 1(EBNA1)是EBV編碼的一種DNA結(jié)合蛋白，在所有與EBV相關(guān)類型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，是病毒潛伏期DNA復(fù)制、游離基因維持和永生化初級(jí) B淋巴細(xì)胞必不可少的蛋白［64，65］。USP7具有去泛素化酶活性，能穩(wěn)定抑瘤蛋白p53并調(diào)控其活性［49］，但 EBNA1會(huì)和 p53競爭與 USP7結(jié)合的位置，進(jìn)而降低p53的穩(wěn)定性，阻止p53的抑瘤功能，促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生［66］。

3.3 肺癌

肺癌根據(jù)生物學(xué)特性，可分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩大類，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的80%～85%。非小細(xì)胞肺癌包括:鱗癌，腺癌，大細(xì)胞癌，鱗腺癌等。在NSCLC患者的樣本中，45%的患者USP7表達(dá)水平降低，44.3%的患者p53發(fā)生突變，且在p53突變或USP7表達(dá)降低的患者中，p53的下游靶基因p21和bax的表達(dá)比在p53野生型或USP7陽性表達(dá)的樣本中明顯降低［67，68］。雖然p53基因的表達(dá)情況與USP7的表達(dá)沒有明顯相關(guān)性，但USP7與p53下游靶基因p21和bax的表達(dá)呈現(xiàn)明顯相關(guān)性，提示USP7是通過p53依賴的途徑來參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程，即USP7通過穩(wěn)定p53發(fā)揮腫瘤抑制的功能作用［67］。另外，同時(shí)有野生型p53和陽性USP7表達(dá)的NSCLC患者的生存期明顯長于USP7表達(dá)減少或p53突變的NSCLC患者。USP7表達(dá)減少的腫瘤患者對(duì)化療和放療耐受，推測USP7基因的下調(diào)可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用［69-71］。

3.4 宮頸癌

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，原位癌高發(fā)年齡為30～35歲，浸潤癌為45～55歲，近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)，發(fā)病原因目前尚不清楚。Rolen等人2006年通過化學(xué)功能蛋白質(zhì)組學(xué)，研究攜帶人乳頭瘤病毒的宮頸癌組織和癌旁組織，發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞中USP7表達(dá)頻率較低(19%)，而在宮頸癌衍生細(xì)胞系和E6/E7永生化的角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)頻率較高(88%)，推斷USP7可能在宮頸癌惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮一定的作用［72］。

4 USP7作為抗腫瘤的分子靶標(biāo)

USP7作為一種重要的去泛素化酶，通過去泛素化多種重要的腫瘤調(diào)節(jié)分子，在腫瘤發(fā)生和演進(jìn)過程中發(fā)揮重要作用，因此以其作為抗腫瘤的分子靶標(biāo)近年來成為研究的熱點(diǎn)。通過小分子化合物庫高通量篩選，已明確多個(gè)USP7的特異性小分子抑制劑。小分子化合物HBX 19818能共價(jià)結(jié)合USP7催化活性位點(diǎn)的Cys223，引發(fā)USP7構(gòu)象改變，顯著抑制USP7的去泛素化酶活性［73］。在體內(nèi)，HBX 19818引起MDM2蛋白表達(dá)水平下降，p53表達(dá)水平上升，導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期阻滯。HBX19818能抑制多種腫瘤細(xì)胞系的生長，包括結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、前列腺癌細(xì)胞DU145、宮頸癌細(xì)胞HeLa等。小分子化合物P5091為三取代噻吩類衍生物，能高度特異性抑制USP7酶的活性，而對(duì)去泛素化酶家族其它成員沒有影響［74］。P5091能抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。由于P5091誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡并不依賴于p53，因此，具有非常重要的臨床價(jià)值，有助于p53突變或缺失的多發(fā)性骨髓瘤患者的治療［75］。同時(shí)，P5091也能抑制對(duì)萬珂、Dexamethasone，Doxorubicin或 Melphalan耐藥的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長。

5 總結(jié)和展望

USP7能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)眾多蛋白底物的活性和功能，包括抑瘤蛋白、瘤蛋白、DNA修復(fù)蛋白、免疫應(yīng)答蛋白、病毒蛋白、表觀遺傳調(diào)節(jié)子等，在疾病的發(fā)生和演進(jìn)過程中起著非常重要的作用，特別是腫瘤和病毒性疾病，因此，以USP7作為分子靶標(biāo)的疾病治療策略將會(huì)有更加廣闊的開發(fā)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。

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