王 芳，張 嵐

(廣州醫(yī)科大學(xué)，醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)教研室，廣東 廣州 510182)

Varp蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新蛋白，可作為小分子GTP結(jié)合蛋白超家族中最大的一個(gè)亞家族--Rab蛋白家族成員Rab21的鳥苷酸轉(zhuǎn)換因子(guanine nucleotide exchange factor，GEF)及 Rab38 的效應(yīng)蛋白(effector)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞及膜轉(zhuǎn)運(yùn)［1，2］。最新研究表明，Varp在黑色素細(xì)胞中可以通過與Rab38/Rab32的相互作用調(diào)節(jié)Tyrp1在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)［3］，還能夠通過調(diào)節(jié)Rab21在黑色素細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞突起的形成過程中發(fā)揮作用［4，5］。目前除了上述研究以外，對這一新蛋白其他功能的了解還非常缺乏。

Varp在許多腫瘤細(xì)胞株中都有表達(dá)，但在人宮頸癌 Hela細(xì)胞中的表達(dá)水平相對更低［1］。因此，Varp是否在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，值得深入研究。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒

空載體pEFNeo、攜帶新霉素抗性基因及c-Myc標(biāo)簽的Varp真核蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒pEFNeo/Varp-Myc為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自Hyclone公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品。新霉素G418(Neomycin)購自 Gibco公司。3H-TdR購自北京原子能研究所。碘化丙啶(PI)購自Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Scientific Pierce公司。小鼠抗c-Myc單克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，用于細(xì)胞免疫熒光的熒光標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自Jackson ImmunoResearch Laboratories。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞系構(gòu)建

Hela細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，放置于37℃，5%二氧化碳濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。按Invitrogen公司說明書方法使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別向Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEFNeo/Varp-Myc質(zhì)粒及空載pEFNeo(作為對照)。轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞并重新分入96孔板中，使每孔約含有10個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后，加入G418，濃度為1 mg/mL。37℃培養(yǎng)細(xì)胞，每4 d換新鮮培養(yǎng)基，G418濃度不變。至有單克隆產(chǎn)生，選取單克隆培養(yǎng)，能夠穩(wěn)定表達(dá) Varp蛋白的細(xì)胞系 Hela通過Western Blotting及細(xì)胞免疫熒光鑒定。

1.4 Western Blotting

收集培養(yǎng)細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量。以50 μg/孔的上樣量進(jìn)行5%濃縮膠及12%分離膠的SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜;轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，c-Myc抗體(1∶1000稀釋)雜交，滴加ECL發(fā)光試劑，在暗室中壓片，顯影，定影。

1.5 細(xì)胞免疫熒光

待檢測細(xì)胞培養(yǎng)至密度50%左右，PBS洗滌，固定液(含4%的多聚甲醛的PBS)室溫固定20 min。PBS洗滌后加入穿透液(含0.2%Triton X-100的PBS)，室溫10 min。PBS洗滌后用封閉液(含10%牛血清的PBS)室溫封閉1 h。一抗室溫孵育1 h(抗c-Myc抗體1∶100稀釋于含2%血清的PBS)或4℃過夜。除去一抗，洗滌液(含0.05%Tween-20，1%BSA的PBS)洗滌。二抗(稀釋度為1∶200)避光孵育，室溫1 h。除去二抗，洗滌液洗滌。DAPI復(fù)染細(xì)胞核，洗滌液洗滌。使用防熒光淬滅封片劑封片。激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

1.6 3H-TdR摻入法測定細(xì)胞增殖曲線

取對數(shù)生長期的Hela/Mock及Hela/Varp細(xì)胞分別接種于24孔板中，每孔5 x 103個(gè)。每種細(xì)胞每天取3孔平行對照測定。分別于接種后48 h、72 h、96 h、120 h 更換含 3H-TdR(1 μCi/孔)的全培養(yǎng)基(更換培養(yǎng)基之前細(xì)胞需血清饑餓24 h)，繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入細(xì)胞裂解液125 μL，待細(xì)胞裂解后，吸取 100 μL至濾膜，37℃干燥后將濾膜放入閃爍瓶中加閃爍液，避光放置2 h后，用Beckman液體閃爍計(jì)數(shù)儀測定每分鐘脈沖數(shù)(counts/min，CPM)。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將Hela/Mock及Hela/Varp培養(yǎng)24 h后胰酶消化收集細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌1遍，加入-20℃預(yù)冷75%乙醇固定，4℃過夜。檢測前預(yù)冷PBS緩沖液洗滌2遍，以含有RNaseA(終濃度20 μg/mL)的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，37℃處理30 min。碘化丙啶(PI)(終濃度50 μg/mL)進(jìn)行染色，避光反應(yīng)15 min后流式細(xì)胞儀(BD，美國)檢測細(xì)胞凋亡水平。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Varp穩(wěn)定表達(dá)的Hela細(xì)胞系的鑒定

用新霉素G418對轉(zhuǎn)染pEFNeo/Varp-Myc質(zhì)粒后的Hela細(xì)胞進(jìn)行篩選，得到具有新霉素抗性的單克隆細(xì)胞。為了排除假陽性細(xì)胞(僅有新霉素抗性基因表達(dá)而無Varp表達(dá))，采取Western Blotting及細(xì)胞免疫熒光對穩(wěn)定表達(dá)Varp蛋白的單克隆細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

2.1.1 Western Blotting結(jié)果 由于Varp真核蛋白表達(dá)載體攜帶c-Myc標(biāo)簽，因此在細(xì)胞中能夠表達(dá)c-Myc-Varp融合蛋白。以小鼠抗c-Myc單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western Blotting檢測，結(jié)果顯示，在7#細(xì)胞克隆中有明顯的c-Myc-Varp融合蛋白表達(dá)(圖1)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)以此細(xì)胞克隆作為Varp穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系Hela/Varp，以空載細(xì)胞Hela/Mock作為對照。

2.1.2 細(xì)胞免疫熒光結(jié)果 以小鼠抗c-Myc單克隆抗體為一抗對Hela/Mock及Hela/Varp進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測，結(jié)果如圖2所示，Varp在Hela/Varp細(xì)胞中表達(dá)，且在核區(qū)更為集中。Hela/Mock中未檢測到熒光信號(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖1 Hela/Varp細(xì)胞系中的Varp表達(dá)Fig.1 Expression of Varp in Hela/Varp stable cell line

圖2 Hela/Varp細(xì)胞免疫熒光(藍(lán)色示細(xì)胞核，綠色熒光示Varp表達(dá))Fig.2 Cell Immunofluorescence in Hela/Varp(Blue:Nucleus Green:Expression of Varp)

2.2 Varp蛋白抑制Hela細(xì)胞增殖

為了檢測Varp蛋白對Hela細(xì)胞增殖的影響，采取3H-TdR摻入法測定各細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示，Hela/Varp的增殖明顯低于Hela/Mock(圖3)。

圖3 Hela/Mock與Hela/Varp細(xì)胞增殖曲線Fig.3 Cell proliferation of Hela/Mock and Hela/Varp

2.3 Varp蛋白增加Hela細(xì)胞凋亡

為了檢測Varp蛋白對Hela細(xì)胞凋亡的影響，采取PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測各細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，Hela/Varp的凋亡率明顯高于Hela/Mock(圖4)。

圖4 Hela/Mock與Hela/Varp細(xì)胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of Hela/Mock and Hela/Varp

3 討論

Varp是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新蛋白，其功能很不明確。宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，由人乳頭瘤病毒(HPV)引起［6］。本研究初步證明Hela細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)Varp后，細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞凋亡率增加。由于Varp能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞及膜轉(zhuǎn)運(yùn)，且已有研究表明過量表達(dá)的Varp能夠降低腺病毒感染細(xì)胞的效率［7］，因此后續(xù)研究將進(jìn)一步檢測其是否能夠在HPV病毒感染細(xì)胞的過程中發(fā)揮作用。另外，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展還與很多細(xì)胞信號通路相關(guān)，例如 MAPK、Notch1、TGF-Smads、Wnt等等信號通路［8-11］。Varp是否在信號分子的細(xì)胞內(nèi)吞、胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)等環(huán)節(jié)起到作用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號通路影響腫瘤細(xì)胞的生長，也是后續(xù)研究中需進(jìn)一步求證的。

宮頸癌的傳統(tǒng)治療手段以手術(shù)、放療、化療為主。近年來，包括基因治療在內(nèi)的生物治療手段，能夠高度選擇性地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而不損傷正常細(xì)胞，為宮頸癌的治療提供了全新的模式。宮頸癌的基因治療主要是通過誘導(dǎo)促凋亡分子或者抑制抗凋亡分子來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。宮頸癌相關(guān)的促凋亡分子包括caspase家族成員、TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF relatedapoptosis inducing ligand，TRAIL)、Fas/FasL等;抗凋亡分子則包括Bcl-2、FLIP(fas-associated protein with death domain-like IL-1β-converting enzyme inhibitory protein)、X-連鎖的抑制凋亡蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)等［12］。因此，后續(xù)研究中還將檢測Varp是否影響了上述宮頸癌相關(guān)促凋亡分子及抗凋亡分子的表達(dá)，從而進(jìn)一步明確Varp影響Hela細(xì)胞凋亡的機(jī)理。

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