楊金偉，田朝暉，韓呈武，于雪瑩，曹永彤

（1.中日友好醫(yī)院 檢驗(yàn)科；2.神經(jīng)內(nèi)科，北京 100029）

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性損傷性改變， 由各種原因的腦血液供應(yīng)障礙引起。目前，關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與免疫系統(tǒng)關(guān)系的研究中，對于T 淋巴細(xì)胞研究比較多，且國內(nèi)外研究結(jié)果一致認(rèn)為ACI 患者T 淋巴細(xì)胞總數(shù)減少。 但對于CD4+T/CD8+T 研究結(jié)果并不一致， 同時(shí)對NK 細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞的研究很少。 本研究通過對29 例ACI 患者的T、B淋巴細(xì)胞亞群和自然殺傷細(xì)胞 （natural killer，NK）的檢測，探討ACI 患者免疫系統(tǒng)的改變，以期為腦梗死患者免疫系統(tǒng)的研究提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2011 年1 月～2013 年12 月我院神經(jīng)內(nèi)科住院的29 例ACI 患者作為研究對象， 入院日期距發(fā)?。?d，入院前3 個(gè)月內(nèi)未使用抗血小板、擴(kuò)血管藥物，未使用激素和免疫抑制劑，排除感染性疾病、腫瘤、冠心病、免疫性疾病、外傷。 診斷符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)；男20 例、女9 例；年齡40～75 歲，平均52±9 歲。頭顱MRI 檢查示新發(fā)腦梗死；入院后抽取次日早晨空腹外周血。 選取29 名門診體檢健康者作對照，其中男20 例、 女9 例； 年齡38～78 歲， 平均55±7歲。

1.2 檢測材料

儀器： 流式細(xì)胞儀， 美國Bekeman-Coulter FC500； 離心機(jī)， 美國Bekeman-Coulter ALLERGAX -12R。

試劑： 熒光標(biāo)記單克隆抗體CD3-PC5/CD4-FITC/CD8-PE，批號IM1650；CD3-FITC/CD（16+56）-PE，批號A07735；CD5-FITC，批號A07753；CD19-PE， 批號IM1284U。 全血溶血試劑：OPTILYSE C。

注： 異硫氰酸熒光素 （fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）——綠色熒光；藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）——橙色熒光； 藻紅蛋白-CY5 耦聯(lián)物（PE-CY5，PC5）——紅色熒光。

1.3 檢測方法

流式細(xì)胞術(shù) （FCM） 檢測T%、Th%、Ts%、NK%、B1%和B2%。 測定前以標(biāo)準(zhǔn)熒光微球校正儀器調(diào)整電壓和顏色補(bǔ)償。 操作方法：靜脈血1～2ml EDTA 抗凝，混勻；取100μl 全血加入型號為12mm×75mm 試管中，加50μl 相應(yīng)的熒光標(biāo)記單克隆抗體，避光孵育20min；裂解紅細(xì)胞：試管中加Optilyse C 500μl 震蕩，室溫孵育15min；洗滌：加入稀釋液約2.5ml 混勻，1500r/min 離心5min，棄上清，加少許稀釋液（0.5ml）。然后上機(jī)檢測。記錄數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 疾病組與對照組T 淋巴細(xì)胞亞群的檢測結(jié)果

疾病組和對照組基線資料均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），樣本符合正態(tài)分布，具有可比性。 表1 示，與正常對照組相比，疾病組CD3+（T）%水平降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CD8+（Ts）%水平顯著降低（P＜0.05）；CD4+（Th）%和Th/Ts 水平均顯著升高（均P＜0.05）。

2.2 疾病組與對照組NK 細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞亞群的檢測結(jié)果比較

表2 示，與正常對照組相比，疾病組NK%水平顯著降低（P＜0.05）；B1%水平升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B2%水平顯著升高（P＜0.05）。

表1 疾病組與對照組T 淋巴細(xì)胞亞群的檢測結(jié)果比較

表2 疾病組與對照組NK 細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞亞群的檢測結(jié)果比較

3 討論

3.1 ACI 與T 淋巴細(xì)胞

ACI 引發(fā)細(xì)胞免疫功能紊亂的機(jī)理尚不清楚。 1979 年CzlonkowskaA 等[1]發(fā)現(xiàn)ACI 外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)減少，T 淋巴細(xì)胞同時(shí)減少，并認(rèn)為與應(yīng)激有關(guān)。 Berczi[2]認(rèn)為腦梗死引起下丘腦-垂體-腎上腺軸功能活動增強(qiáng)， 產(chǎn)生大量的腎上腺皮質(zhì)激素，使CD3+T、CD4+T 淋巴細(xì)胞數(shù)下降，從而抑制了機(jī)體免疫力。Fiorina[3]觀察到腦梗死患者與血漿褪黑素（MT）水平的降低有關(guān)，與腎上腺皮質(zhì)激素水平無關(guān)。 Gendron[4]報(bào)道左右大腦皮質(zhì)的不同部位的損害在免疫反應(yīng)中發(fā)揮的作用不同， 同時(shí)對淋巴細(xì)胞的變化進(jìn)行了進(jìn)一步的分類。 Campanella M 等[5]運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)腦梗死小腦組織進(jìn)行細(xì)胞分離后檢測發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞顯著增加， 進(jìn)一步說明外周血T 淋巴細(xì)胞的減少可能是由于大量進(jìn)入中樞所致。 本研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，Th%、Th/Ts 的均值較正常對照組高；T%和Ts%的均值較正常對照低。Th%、Ts%、Th/Ts 的結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初發(fā)性ACI患者T%的值較正常對照值偏低，這與國內(nèi)外所有的報(bào)道一致。 但是Th%、Ts%和Th/Ts 的結(jié)果與部分報(bào)道[7～9]不一致，可能與腦梗死檢測的不同時(shí)期有關(guān)。 T 淋巴細(xì)胞對機(jī)體免疫功能起著重要的調(diào)節(jié)作用， 尤其是輔助性T 細(xì)胞（Th）和抑制性T 細(xì)胞（Ts）之間的相互協(xié)調(diào)，產(chǎn)生適度的免疫應(yīng)答，同時(shí)維持機(jī)體自身的免疫耐受。 本實(shí)驗(yàn)以CD3、CD4 及CD8 這3 個(gè)T 細(xì)胞表面分子的表達(dá)為依據(jù)， 劃分Th 和Ts 細(xì)胞。CD3+為總T 淋巴細(xì)胞， 它可分為2 個(gè)主要亞群，CD4+和CD8+細(xì)胞。CD4+為輔助/誘導(dǎo)（Th/Ts），具有輔助效應(yīng)T 細(xì)胞活化、介導(dǎo)B 細(xì)胞抗體生成和活化巨噬細(xì)胞等功能；CD8+為抑制殺傷細(xì)胞， 具有抑制T 細(xì)胞活化，抑制抗體產(chǎn)生和產(chǎn)生細(xì)胞毒等作用。 T 淋巴細(xì)胞亞群中Th 和Ts 細(xì)胞對免疫反應(yīng)起調(diào)控作用，相互誘導(dǎo)、相互制約形成的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)對調(diào)控和維持免疫反應(yīng)穩(wěn)定起重要作用， 以免發(fā)生過度反應(yīng)損傷機(jī)體[10]。 當(dāng)T 淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)， 機(jī)體可產(chǎn)生免疫紊亂而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病。 通過檢測T 淋巴細(xì)胞亞群的變化，可以輔助判斷ACI 患者的免疫狀態(tài)，用于指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后。

3.2 ACI 與NK 細(xì)胞

NK 細(xì)胞 （自然殺傷細(xì)胞） 介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，它不依賴抗體和補(bǔ)體，即能直接殺傷靶細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞或受病毒感染的細(xì)胞等；此外，尚有免疫調(diào)節(jié)功能， 也參與移植排斥反應(yīng)和某些自身免疫病的發(fā)生發(fā)展。 NK 細(xì)胞作用于靶細(xì)胞后殺傷作用出現(xiàn)早，體內(nèi)4h 即可見到殺傷效應(yīng)。 NK 細(xì)胞的靶細(xì)胞主要有某些腫瘤細(xì)胞 （包括部分細(xì)胞系）、病毒感染細(xì)胞、某些自身組織細(xì)胞（如血細(xì)胞）、寄生蟲等，因此NK 細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的重要免疫因素。 在ACI 患者中，NK 細(xì)胞的含量顯著減少（P<0.05），說明腦梗死患者體內(nèi)產(chǎn)生了自然殺傷作用或者免疫調(diào)節(jié)功能， 具體的意義還沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

3.3 ACI 與B 淋巴細(xì)胞

Urra 等[6]研究認(rèn)為腦梗死后可出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的免疫抑制綜合征， 中樞神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)通過神經(jīng)通路相互聯(lián)系， 體液與細(xì)胞通過細(xì)胞因子相互聯(lián)系。 李娟等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ACI 中B淋巴細(xì)胞數(shù)增多，B 淋巴細(xì)胞主要是通過分泌細(xì)胞因子和免疫球蛋白參加免疫反應(yīng)。 B1 細(xì)胞為T細(xì)胞非依賴性細(xì)胞，B2 為T 細(xì)胞依賴性細(xì)胞。 B細(xì)胞在體內(nèi)存活的時(shí)間較短，僅數(shù)天至數(shù)周，但其記憶細(xì)胞在體內(nèi)可長期存在。 成熟B 細(xì)胞接受抗原刺激后， 在抗原提呈細(xì)胞和Th 細(xì)胞的輔助下成為活化B 細(xì)胞，進(jìn)而分化為漿細(xì)胞，合成和分泌各類免疫球蛋白。 本實(shí)驗(yàn)研究的數(shù)據(jù)顯示B1%和B2%的均值較正常對照組高，這與李娟等[11]的研究結(jié)果一致。 T 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子刺激B 細(xì)胞增殖并產(chǎn)生免疫球蛋白與體液免疫有關(guān)。 此次實(shí)驗(yàn)中，Th%、B1%和B2%的均值較正常對照組高，說明機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫都被激發(fā)，體液與細(xì)胞通過細(xì)胞因子相互聯(lián)系， 促炎因子與抗炎因子間的平衡不僅決定了免疫應(yīng)答， 而且影響受損腦組織的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后。

ACI 與T、B 淋巴細(xì)胞亞群和NK 細(xì)胞的關(guān)系復(fù)雜， 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示T 淋巴細(xì)胞被抑制，Th/Ts比例改變，B 淋巴細(xì)胞被激活，NK 細(xì)胞發(fā)生自然殺傷作用而消耗， 對于輔助判斷機(jī)體的免疫狀態(tài)和預(yù)防感染具有指導(dǎo)意義。 由于收集的數(shù)據(jù)量較少，T、B 淋巴細(xì)胞亞群和NK 細(xì)胞在ACI 中的變化和作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[1] Czlonkowska A，Cyrta B，Korlak J.Immunological observations on patients with acute cerebral vascular disease [J].J Neurol SCI，1979，43（3）：455-464.

[2] Berczi I.The stress concept and neuroim munoregulation in modern biology[J].Ann NY Acad Sci，1998，851：3-12.

[3] Fiorina P，Lattuada G，Silvestrini C，et al.Disruption of nocturnal melatonin rhythm and immunological invovment in ischaemic stroke patients [J].Scand J Immunod，1999，50（2）：228-231.

[4] Gendron A，Teitelbaum J，Cossette C，et al.Temporal effects of left versus right moddle cerebral artery occlusion on spleen lymphocyte subsets and mitogetic response in Wistar rat[J].Brain Res，2002，955（1-2）：85-97.

[5] Campanella M，Sciorati C，Tarozzo G，et al.Flow cytometric analysis of inflammatory cells in ischemic rat brain [J].Stroke，2002，33（2）：586-592.

[6] Urra X，Obach V，Chamorro A.Stroke induced immunodepression syndrome：from bench to beside [J].Current Molecular Medicine，2009，9（2）：195-202.

[7] 許治強(qiáng)，彭光瑩，曾揚(yáng)濱，等.腦梗死患者免疫功能狀態(tài)與激光血管內(nèi)照射治療的研究[J].廣東醫(yī)學(xué)，1996，17（4）：226-227.

[8] 許榮家，范紅，李怡，等.魚肝油對急性期腦梗死患者血清維生素A 和細(xì)胞免疫水平的影響及相關(guān)性研究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，1998，15（4）：213-215.

[9] 苗建亭，雷革盛，李柱一，等.急性腦血管病患者紅細(xì)胞免疫功能和T 淋巴細(xì)胞亞群變化的初步研究[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)學(xué)雜志，2001，8（1）：23-25.

[10] 鄭琳.T 淋巴細(xì)胞亞群檢測在60 例急性腦梗死患者中的應(yīng)用研究[J].實(shí)用醫(yī)技雜志，2012，19（5）：536.

[11] 李娟，栗秀初，馮幼啟.紫外線照射自血回輸對腦梗死患者外周血淋巴細(xì)胞亞群和血漿纖維連接蛋白的影響[J].中華理療雜志，1995，8（2）：74-76.