何虎翼， 譚冠寧， 何新民， 何海旺， 李麗淑， 唐洲萍， 王 暉

廣西農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，南寧530007

廣義上來說，遺傳多樣性是指種內(nèi)或種間表現(xiàn)在分子、細胞、個體三個水平的遺傳變異度。在研究甘薯遺傳多樣性時，多采用其狹義上的含義，即指種內(nèi)不同群體和個體間的遺傳多態(tài)性程度。遺傳多樣性是維持生物繁殖活力、抗病蟲害能力和適應環(huán)境變化的基礎，也是人類改良和創(chuàng)造新栽培植物的源泉。為了分析植物遺傳多樣性，人們已經(jīng)從形態(tài)學水平、細胞學水平、生化水平和分子水平進行了深入研究。由于DNA分子標記具有數(shù)量極大、不受環(huán)境及基因表達與否限制、利于隱性性狀選擇、不影響目標性狀表現(xiàn)等優(yōu)點，現(xiàn)已在遺傳多樣性研究中得到廣泛應用。

雙子葉植物甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)屬旋花科甘薯屬，是世界上重要的糧食、飼料、工業(yè)原料和新型能源作物。甘薯在中國已有400多年栽培歷史，種植面積占世界的65.4%，產(chǎn)量占85.9%。在目前育成的甘薯品種中，約94%具有南瑞苕和沖繩100號的血緣，遺傳基礎相當狹窄，嚴重影響新品種選育工作。雖然已經(jīng)保存了近600份甘薯地方品種，但這些地方品種的遺傳多樣性沒有明確。在分析地方品種遺傳多樣性基礎上拓寬育種材料的遺傳背景，有助于優(yōu)良親本的選擇和輔助育種，對甘薯品種遺傳改良具有重要意義。

1 分子標記技術概述

DNA分子標記技術研究始于19世紀80年代，現(xiàn)有的分子標記技術已有數(shù)十種。由于甘薯染色體數(shù)目多且小，存在自交不親和及同一不育群體內(nèi)品種間雜交不親和問題，其遺傳背景復雜，農(nóng)藝性狀的觀察和分析難以真實反映其親緣關系，而DNA分子標記不受環(huán)境影響，穩(wěn)定性好，已經(jīng)成為甘薯種質(zhì)資源研究的重要手段。目前在甘薯育種研究中主要采用以PCR擴增技術為基礎的RAPD、AFLP和ISSR標記。

隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是以10 bp左右的隨機引物通過PCR反應非定點擴增DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離、染色來顯示擴增 DNA片段多態(tài)性［1］。RAPD標記不依賴于種屬的特異性，操作簡單，成本較低，DNA樣品用量少，復性溫度低，但難以區(qū)別純合體和雜合體，易受反應條件影響，擴增穩(wěn)定性和實驗重復性差。擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)是將基因組DNA用限制性內(nèi)切酶雙酶解后，將雙鏈人工接頭連接到酶切后的片段的兩端，用帶有選擇性堿基的引物進行選擇性擴增，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測DNA序列的多態(tài)性［2］。AFLP標記多態(tài)性高，模板用量少，穩(wěn)定性好，但技術受專利保護，DNA純度和內(nèi)切酶質(zhì)量要求高。簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)是根據(jù)相對保守的微衛(wèi)星DNA兩端單拷貝序列設計一對特異引物，通過PCR反應擴增微衛(wèi)星片段來揭示微衛(wèi)星DNA的多態(tài)性［3］。SSR標記多態(tài)性頻率高，多為單一多等位基因位點，可鑒別純合和雜合基因型，重復性高，穩(wěn)定可靠，DNA用量少，但引物設計是其難點。簡單重復序列間擴增(inter-simple sequence repeats，ISSR)就是在SSR的3'端或5'端加錨1～4個嘌呤或嘧啶堿基，并以此為引物，對兩側(cè)具有反向排列SSR的一段DNA序列進行擴增，經(jīng)電泳、染色，根據(jù)譜帶的有無及相對位置來分析樣品間的多態(tài)性［4］。ISSR標記是共顯性，成本較低、重復性好、多態(tài)性較高，其缺點在于需要摸索PCR最適反應條件，不能用來區(qū)分純合和雜合基因型。相關序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)通過獨特的雙引物設計對基因的ORFs的特定區(qū)域進行擴增［5］。SRAP標記在基因組中均勻分布，多態(tài)性強，DNA用量少，效率高、共顯性、重復性好，但沒有利用擴增區(qū)域序列的任何信息，產(chǎn)生的標記隨機分布在染色體上。上述均為基于PCR擴增的分子標記技術，DNA用量均在0.2 g左右，各自特點對比見表1。

表1 幾種基于PCR的DNA分子標記技術的比較Table 1 Comparison of several PCR-based DNA molecular markers.

2 遺傳差異分析

在甘薯育種中，為了有效利用優(yōu)異種質(zhì)資源，必須首先對甘薯種質(zhì)資源親緣關系和遺傳多樣性進行評價。隨著DNA分子標記的迅速發(fā)展，各種分子標記技術都已應用于甘薯遺傳多樣性分析中(見表2)。

2.1 甘薯地方品種與主要育成品種的遺傳差異分析

李強等［12］用10對 AFLP引物和17條 ISSR引物對26份中國甘薯主要育成品種進行遺傳多樣性分析時，發(fā)現(xiàn)中國甘薯主要育成品種間遺傳相似度高，南方薯區(qū)品種遺傳差異高于北方薯區(qū)和長江中下游薯區(qū)，通過加強不同薯區(qū)育種親本交換可以逐步改變中國育成品種遺傳基礎狹窄現(xiàn)狀。張超凡等［16］利用12對SSR引物對31份湖南甘薯品種進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)每對引物可獲得6個等位基因位點，因此，湖南甘薯品種遺傳多樣性較豐富。宋吉軒等［21］利用7個ISSR引物對收集的45份貴州甘薯種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)它們之間親緣關系較近。

表2 甘薯遺傳多樣性的相關報道Table 2 The related reports of sweet potato genetic diversity.

2.2 我國甘薯種質(zhì)資源保存與多樣性分析

利用20對SSR引物對24份甘薯材料進行遺傳多樣性分析，趙冬蘭等［17］發(fā)現(xiàn)離體保存5年和8年的效果相同，我國保存的甘薯種質(zhì)資源還是較豐富的。羅文彬等［22］利用15個ISSR引物檢測34份甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性，并劃分為4大類，明確了所保存的甘薯種質(zhì)資源的遺傳背景。為了解不同用途甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性，陳新起等［23］利用11個ISSR引物對10個菜用甘薯材料進行遺傳多樣性分析，顯示菜用甘薯材料遺傳差異較大，為菜用甘薯雜交親本選配提供依據(jù)。黃潔等［24］利用17對 ISSR引物對21份紫肉、28份紅黃肉甘薯種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)紫薯和紅黃薯具有不同的來源，同一育種單位的品種親緣關系較近。

2.3 甘薯的起源與進化研究

賀學勤等［6］用30個RAPD引物、9對 AFLP引物和14個ISSR引物對來自安徽、福建、河南和廣東的48個甘薯地方品種進行遺傳多樣性分析，揭示中國是甘薯的次生多樣性中心，作為最早引入地，廣東的地方品種遺傳變異高，可重點加以利用。利用AFLP標記技術，Zhang等［14］對來自拉丁美洲4個不同地理區(qū)域的馬鈴薯品種開展遺傳多樣性分析，結(jié)果表明中美洲是甘薯多樣性的第一中心，秘魯－厄瓜多爾被認為是甘薯多樣性的第二中心。Huang和Sun［25］對40個番薯屬植物進行分析，發(fā)現(xiàn)高多態(tài)性ISSR標記能更好地實現(xiàn)種內(nèi)分離，進而推斷出Ipomoea triloba是甘薯的祖先之一。在育種中，常需要將栽培種與野生種進行差異比較。Hu等［26］用8個ISSR引物評估34個甘薯栽培種或野生種的遺傳多樣性和親緣關系，認為ISSR標記適合于栽培甘薯和野生種的指紋分析，可用于構建甘薯連鎖圖譜。

2.4 甘薯品種的地域差異分析

Liu等［13］利用AFLP標記技術對中國主要甘薯品種進行遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)遺傳變異主要存在于區(qū)域內(nèi)，區(qū)域間的變異水平非常低。但以長江為分界線，北方地區(qū)和南方地區(qū)甘薯品種之間存在顯著的遺傳變異。郝玉民等［29］利用6對SRAP引物對36個甘薯品種進行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)亞洲品種和美洲品種、近緣野生種與育成品種、中國育成品種之間有較高的遺傳相似度。李強等［27］用17個ISSR引物對62份甘薯主要親本材料進行遺傳多樣性分析，表明中國自育親本與外引親本間遺傳距離較遠，在未來育種中，可以用國內(nèi)自育親本與外引親本、亞洲親本與其他外引親本配制雜交組合。

2.5 國外品種資源的遺傳多樣性分析

用引物SP20、SP06、A69和 A71檢測印度尼西亞東爪哇省12個甘薯品種的遺傳多樣性，可分成兩大類，但其中3個品種沒有擴增條帶，無法做進一步鑒定［7］。Moulin 等［8］用 18 個 RAPD 引物和19個ISSR引物，對來自巴西里約熱內(nèi)盧農(nóng)村和當?shù)厥袌?2個甘薯品種進行遺傳多樣性分析，遺傳相似系數(shù)分別為0.80和0.89，表明傳統(tǒng)農(nóng)戶保存甘薯品種有很好的遺傳多樣性。Elameen等［15］對97個坦桑尼亞甘薯種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示 AFLP標記可用來檢測所收集種質(zhì)的重復性，是描述甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關系的有效工具。為了解不同地理環(huán)境條件下甘薯種質(zhì)資源親緣關系，吳覲宇等［28］利用10個ISSR引物對25份美國甘薯材料進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)這些材料遺傳多樣性較高，其中6-3-1、6-8-7可用于國內(nèi)甘薯育種。

3 親緣聚類分析

除用于甘薯遺傳差異分析外，分子標記也可用于甘薯種質(zhì)親緣關系分析。在譜系親緣關系分析中，15種RAPD隨機引物可將17個甘薯品種及其近緣野生種聚類成三個類群，三裂葉野牽牛單個野生種組成A類群，B類群由四倍體和六倍體三淺裂野牽牛及12個甘薯品種組成，海濱野牽牛和二倍體三淺裂野牽牛組成C類群［9］。用26個多態(tài)性引物對中國30個甘薯主栽品種RAPD聚類分析表明，地域分布相近的甘薯品種或具有同一親本的甘薯品種聚類在一起［10］。利用RAPD分子標記獲得的育成品種聚類結(jié)果表明，地方品種中“四季種”和“保亭種”遺傳距離最近，地方品種與中國主要育成品種遺傳距離較遠，這與已知甘薯品種系譜圖吻合度較高［11］。Veasey 等［18］調(diào)查巴西圣保羅傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)家庭78個甘薯品種，SSR聚類分析表明高遺傳和品種內(nèi)多樣性。Yada等［19］用10對熒光標記的SSR引物分析192份烏干達甘薯種質(zhì)，表明聚成的四大類沒有明顯的起源親緣關系，約190個可作為潛在的父母本基因型。吳潔等［30］利用30對SRAP引物對86份甘薯種質(zhì)資源進行親緣關系分析，結(jié)果表明這些甘薯種質(zhì)資源可分為四大類，其中四川省育成的甘薯品種遺傳范圍較狹窄。

在遺傳多樣性與性狀特征標記方面，Koussao等［20］用28對SSR引物評估非洲布基納法索112個甘薯品種的多樣性，發(fā)現(xiàn)遺傳相似系數(shù)為0.49，與形態(tài)特征標記之間沒有相關性。為了分析48份主要甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性，張凱等［31］利用37對SRAP引物進行檢測，發(fā)現(xiàn)SRAP標記聚類結(jié)果與系譜吻合，但與依據(jù)農(nóng)藝性狀聚類結(jié)果相差較大，且種質(zhì)資源間遺傳差異與地理來源無關。

4 展望

理想的分子標記要求具有高多態(tài)性、共顯性遺傳、均勻遍布整個基因組、成本低廉、重復性好、檢測快捷、能辨別等位基因等特點。通過對幾種基于PCR技術的分子標記進行比較分析發(fā)現(xiàn)，與SSR標記相比，ISSR引物開發(fā)費用低，可以在不同物種間通用。與RAPD單引物相比，ISSR揭示的多態(tài)性百分率較高，且由于其具有較高的退火溫度、重復性好、穩(wěn)定性高［32］。相對于AFLP而言，ISSR費用較低，反應體系具有一定的通用性，操作簡單，可廣泛應用。ISSR揭示的地區(qū)內(nèi)(間)品種間的遺傳差異水平高于RAPD和AFLP，這可能是由于在甘薯屬中存在大量的微衛(wèi)星變異造成的［33］。與SRAP相比，ISSR所用引物更少，效率更高。不同分子標記間遺傳多樣性參數(shù)比較分析結(jié)果表明，ISSR和 SSR參數(shù)值間差異顯著，與RAPD、AFLP不宜直接比較，而RAPD和AFLP參數(shù)間可以直接比較［34］。ISSR既可以區(qū)分遺傳相似系數(shù)較近的甘薯品種資源，也能區(qū)分遺傳距離較遠的甘薯種質(zhì)資源，是一種共顯性、成本較低、重復性好、多態(tài)性較高、非常有發(fā)展前途的分子標記，已廣泛應用到基因組作圖和基因定位、物種親緣關系和系統(tǒng)分類、基于圖譜克隆基因和輔助育種等研究中。

對表2總結(jié)的已有研究結(jié)果做進一步比較分析，發(fā)現(xiàn)ISSR標記所需引物數(shù)量最少，一般為12～15條;從多態(tài)性百分率來看，RAPD最高，其次是SRAP和ISSR，AFLP最低;AFLP的遺傳相似系數(shù)變化范圍最大，ISSR次之，RAPD、SRAP和SSR相差不大;從單引物能區(qū)分的種質(zhì)資源數(shù)量來看，ISSR最多，其次是 AFLP和 SSR，SRAP最少。賀學勤等［6］分析了48個甘薯地方品種遺傳多樣性，認為ISSR退火溫度較高，穩(wěn)定性好，在分析甘薯遺傳多樣性方面要強于RAPD，這與Chowdhury等［32］的結(jié)論一致。通過比較 RAPD、ISSR和AFLP三種分子標記在檢測甘薯品種間遺傳差異上的應用效果，賀學勤等［35］發(fā)現(xiàn)ISSR標記估計的品種間遺傳距離大于RAPD和AFLP標記的估計值，ISSR標記更適于分析甘薯品種的親緣關系。通過對26份中國甘薯主要育成品種進行遺傳多樣性分析，李強等［12］發(fā)現(xiàn)雖然AFLP標記引物在每個品種中擴增條帶數(shù)平均比ISSR標記多6條，但ISSR標記擴增多態(tài)性條帶比AFLP標記高27.19%。Moulin等［8］對來自巴西里約熱內(nèi)盧農(nóng)村和當?shù)厥袌?2個甘薯品種進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)ISSR和RAPD這兩種標記結(jié)果有較好的一致性。雖然ISSR標記多態(tài)性比RAPD標記略低4.3%，但表型相關系數(shù)比RAPD標記高出0.09。綜合考慮，ISSR標記遺傳多態(tài)性相對較好，可以實現(xiàn)用最少的引物來區(qū)分數(shù)量最多、遺傳距離較遠的甘薯種質(zhì)資源。值得注意的是，在將ISSR標記技術應用于不同作物時，需要探索PCR反應最適條件。

在上述有關甘薯研究的19篇相關文獻中，應用RAPD有6篇，AFLP有5篇，SSR有5篇，ISSR有11篇，SRAP有3篇，這表明ISSR分子標記技術已經(jīng)被廣泛應用到甘薯遺傳多樣性分析中。它不僅被用來分析國內(nèi)甘薯品種遺傳差異，也用于分析國外甘薯材料遺傳多樣性;或用于分析不同用途甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性，還可用于分析不同地域甘薯種質(zhì)資源的親緣關系。隨著甘薯品種改良工作的不斷推進，為適應甘薯品種抗多種病蟲害、用途多樣化的需求，未來分子標記將會成為揭示甘薯種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要技術手段。由于ISSR標記技術的廣闊應用前景，今后我們應該加強ISSR標記技術的應用研究，通過與提取程序化、電泳膠片分析自動化、信息(數(shù)據(jù))處理計算機化相結(jié)合，開發(fā)出成本更低、分析速度更快、信息量更大的分子標記技術，以期為遺傳多樣性研究和評估提供強大支持。

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