張婷婷 劉 晶 張 莉

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 泰安 271000)

作為真菌中最常見(jiàn)的條件致病菌，念珠菌又名假絲酵母菌，它廣泛的存在于自然界，尤其是水、蔬菜、水果、奶制品中[1]。正常情況下念珠菌可存在于健康人的口腔、腸道、陰道等處，無(wú)致病性,但當(dāng)人體抵抗力下降時(shí)，其作為條件致病菌,感染呈上升趨勢(shì)[2]。其中以白色念珠菌最為常見(jiàn)，致病力也最強(qiáng)。(近年來(lái)，由于糖尿病，肺結(jié)核，腫瘤，嚴(yán)重?zé)齻?，臟器移植等基礎(chǔ)疾病的發(fā)生，而導(dǎo)致的患者機(jī)體免疫力下降以及由此引發(fā)的念珠菌感染呈現(xiàn)高發(fā)的趨勢(shì)。因此，準(zhǔn)確，快速的念珠菌鑒定，及時(shí)的向臨床醫(yī)師提供可靠的確診報(bào)告就成為檢驗(yàn)科微生物室亟待解決的課題。)因不同的真菌菌落所表現(xiàn)特征差別顯著，如念珠菌在普通瓊脂、血瓊脂與沙保弱培養(yǎng)基上，具有生長(zhǎng)良好，菌落為灰白色或奶油色，表面光滑等特點(diǎn)，可為真菌分類(lèi)工作提供重要的診斷依據(jù)。筆者自2009 年8月至2013年6月對(duì)我院微生物室收集的105例念珠菌陽(yáng)性標(biāo)本,分別采用直接顯微鏡菌落觀察法、顯微鏡不染色直接鏡檢及革蘭氏染色法進(jìn)行了鑒定實(shí)驗(yàn)，試圖對(duì)比分析出何種鑒定方法更加準(zhǔn)確快速及時(shí)，以更好的服務(wù)于臨床診斷治療。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源：我院自2009年8月至2013年6月臨床科室送檢細(xì)菌培養(yǎng)念珠菌陽(yáng)性標(biāo)本105例，其中痰62例、尿32例，血培養(yǎng)2例，其它標(biāo)本9例。

1.2方法：①直接顯微鏡菌落觀察法：將培養(yǎng)后的念珠菌的沙保弱(或中國(guó)藍(lán))折光性較好的平板，直接放置于顯微鏡(奧林帕斯)上，調(diào)動(dòng)細(xì)螺旋，用低倍鏡仔細(xì)觀察菌落。②顯微鏡不染色直接鏡檢法：用取菌環(huán)取菌落置于滴有無(wú)菌生理鹽水的涂片上，在顯微鏡下觀察。③革蘭染色法：常規(guī)涂片革蘭染色鏡檢(注明染色液試劑品牌，公司)。

2 結(jié) 果

2.1三種方法的鏡下觀察情況 ①直接顯微鏡菌落觀察：可以看到背景下多個(gè)的圓形的菌落，普通的細(xì)菌菌落區(qū)別于黃色的普通細(xì)菌菌落而念珠菌的菌落為黑色、均勻的細(xì)砂粒狀(見(jiàn)圖1、圖2)，在營(yíng)養(yǎng)豐富的生長(zhǎng)條件下還能很明顯看到芽生孢子，這是區(qū)別于其它細(xì)菌的顯著特點(diǎn)。鏡下觀察普通細(xì)菌菌落無(wú)論如何調(diào)整焦距及變換視野，菌落鏡下菌落形態(tài)不會(huì)有任何明顯變化，而只能觀察到菌落呈現(xiàn)均一的黃色，沒(méi)有細(xì)沙粒狀的形態(tài)。②顯微鏡不染色直接鏡檢法：陽(yáng)性標(biāo)本可見(jiàn)有菌絲、孢子或單細(xì)胞真菌[3]。③革蘭染色法：念珠菌為革蘭染色陽(yáng)性，菌體圓形或卵圓形。

2.2三種方法的操作步驟和耗時(shí)情況 見(jiàn)表1。

表1 三種方法的操作步驟和耗時(shí)情況

*方法1和方法2比較，**方法1和方法3比較，***方法2和方法3比較。

這三種方法所消耗的時(shí)間為同一個(gè)熟練的技術(shù)操作人員在相同的實(shí)驗(yàn)條件下分別對(duì)105個(gè)樣本進(jìn)行觀察和操作所分別消耗的時(shí)間的平均值。P<0.05,時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 ：念珠菌的菌落為黑色、均勻的細(xì)砂粒狀(×10)；

圖2 ：念珠菌的菌落為黑色、均勻的細(xì)砂粒狀，圖中可以清楚的看到芽生孢子(×10)；

圖3 普通的細(xì)菌菌落，菌落呈現(xiàn)均一的黃色

圖4 普通的細(xì)菌菌落，菌落呈現(xiàn)均一的黃色(×10)。

3 討 論

真菌為真核細(xì)胞性微生物，在自然界分布廣泛，種類(lèi)繁多，數(shù)量極大，其中絕大多數(shù)對(duì)人類(lèi)有益，但少數(shù)也可引起感染性、中毒性以及反應(yīng)性疾病。尤其近年來(lái)，伴隨著腫瘤，慢性消耗性疾病和器官移植后免疫抑制劑的使用而發(fā)生的真菌并發(fā)感染呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，成為醫(yī)院難治性感染疾病的重要組成部分，因此，尋找一種準(zhǔn)確快速高效的念珠菌鑒定方法就成為檢驗(yàn)科微生物室當(dāng)前的重要工作目標(biāo)。但是念珠菌菌落在不同成分的培養(yǎng)基上所呈現(xiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)并不完全相同，因此我們對(duì)目前常用的三種念珠菌鏡下檢驗(yàn)方法進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以確定何種方法更加準(zhǔn)確快速，以期更好的服務(wù)于臨床工作。通過(guò)本研究的三種念珠菌鑒定方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，不染色鏡檢法是較為直接快速的檢驗(yàn)方法，特別是對(duì)于細(xì)胞和酵母菌，能通過(guò)顯微鏡最直觀的做出鑒別，但是消耗的時(shí)間多于直接菌落觀察法(P<0.05)。

革蘭染色法作為最為經(jīng)典的染色法，仍是我們常規(guī)工作中的首選。經(jīng)革蘭染色后孢子在顯微鏡下很易識(shí)別，標(biāo)本陽(yáng)性率較高,但是相對(duì)于其它兩種方法，耗時(shí)較長(zhǎng)，步驟繁多。

直接顯微鏡菌落觀察法較為簡(jiǎn)單，不需要涂片、染色，操作更為容易。而且對(duì)于培養(yǎng)后的培養(yǎng)皿上，在念珠菌和細(xì)菌較難鑒別時(shí)，此法更能直接作出判斷。在三種方法中耗時(shí)最短，步驟簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確高效。因此，從2009年8月至今，我院微生物室工作人員通過(guò)運(yùn)用直接顯微鏡菌落觀察法后，不僅提高了工作效率、節(jié)省了時(shí)間，而且還節(jié)約了成本，通過(guò)與染色法對(duì)照實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對(duì)念珠菌檢驗(yàn)無(wú)一例漏檢。優(yōu)于其它方法，值得推廣應(yīng)用，由此證明念珠菌的直接菌落鏡檢法具有準(zhǔn)確快速高效的特點(diǎn)，在今后的臨床檢驗(yàn)工作中可以發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，更經(jīng)濟(jì)更有效的豐富日常檢驗(yàn)技術(shù)方法。

[1] 葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜．全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].第3版．南京：東南大學(xué)出版社．2006：235-237.

[2] 沈雪敏，薛婷君，施琳俊,等. 小檗堿對(duì)白色念珠菌細(xì)胞周期的影響[J].中國(guó)口腔醫(yī)學(xué)雜志,2012,47(1):123-126.

[3] 陳佩宣.念珠菌快速測(cè)定試劑盒的選擇[J].2011,8(2):226-227.