黑龍江 張玉瑤 王吉錫 劉洋

前言

苦參出自《本草經(jīng)百種錄》，是豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根。其主要成分是苦參堿（matrine）與氧化苦參堿（oxymatrine），在一定條件下，二者還可相互轉(zhuǎn)化。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為苦參素有清熱利濕、祛風(fēng)殺蟲、利尿之功。而苦參素中98%以上的成分為氧化苦參堿[1]。大量藥理和臨床研究中發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤作用及對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、解熱、降溫作用，特別是在慢性肝炎和肝纖維化等方面的治療已取得良好療效，且不良反應(yīng)較少[2]。

氧化苦參堿的心血管藥理研究表明其具有抗心律失常、改善血流動(dòng)力學(xué)和降壓、抗心肌缺血、抗心室重構(gòu)等作用。大鼠心電圖證明，氧化苦參堿具有明顯的負(fù)性頻率和負(fù)性傳導(dǎo)作用，可能是其抗心律失常作用的基礎(chǔ)。豚鼠乳頭肌試驗(yàn)證明它可加強(qiáng)心肌的收縮力，提示其具有改善心功能的作用[3]?？鄥⒖倝A能擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈血流量，有一過性的降壓作用，能延長小鼠在常壓下的耐缺氧時(shí)間[4]。

隨著電生理技術(shù)的進(jìn)步，利用細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究氧化苦參堿對(duì)離子通道電流的作用，可進(jìn)一步明確其抗心律失常的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用純度98%以上的氧化苦參堿，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄單細(xì)胞L型鈣電流，以探討氧化苦參堿起抗心律失常作用的心室肌細(xì)胞電生理學(xué)機(jī)制，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

健康成年豚鼠，雌雄兼用，體重（230±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP中心提供。

1.1.2 藥品與試劑

氧化苦參堿純度大于98%，由中國藥品生物制品檢定所提供；HEPES、EGTA、Na2ATP、小牛血清蛋白（BSA）、膠原酶Ⅱ等購自Sigma公司。

1.1.3 主要儀器

膜片鉗放大器，Axonpatch200B，Axon Instrument，U.S.A；數(shù)模轉(zhuǎn)換器，DigiData 1322A，Axon Instrument，U.S.A；微電極拉制儀，PP830型，Narishige Co.LTD.，Japan；像差倒置顯微鏡，OLYMPUSIX70，Japan；Langendorff灌流裝置，上海。

1.1.4 軟件

記錄程序：Pclamp 9.2，Axon Instrument，California，U.S.A；分析程序：Clampfit8.0，Axon Instrument，California，U.S.A；Sigmaplot5.0.

1.1.5 溶液[5,6]

正常臺(tái)氏液（Tyrode’s solution,mmol·L-1）：NaCl 126，KCl5.4，CaCl2 1.8，NaH2PO4 0.33，MgCl2 1.0，HEPES10，Glucose10，用NaOH調(diào)pH至7.4。無鈣臺(tái)氏液（Calcium-free Tyrode’s solution，mmol·L-1）：除沒有CaCl2之外，其余成分與正常臺(tái)氏液相同。細(xì)胞保存液（KB solution，mmol·L-1）：Glutamic acid 70，Taurine15，KCl 30，HEPES10，KH2PO410，MgCl20.5，EGTA0.5，Glucose10，用KOH調(diào)pH至7.3～7.4。電極液（Pipette solution，mmol·L-1）：KCl20，Potassium Asparate110，HEPES5，MgCl21.0，EGTA 10，Na2ATP 5，用KOH調(diào)pH至7.2。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠單個(gè)心肌細(xì)胞的分離[7]

豚鼠撞擊頭部致昏，仰臥位固定，開胸取心臟置于4℃臺(tái)氏液中，剝離主動(dòng)脈連接于Langendorff灌流裝置上，以8m l·min-1流速連續(xù)灌流約5min后，無鈣臺(tái)氏液灌流至心臟停搏。0.02%膠原酶Ⅱ的無鈣臺(tái)氏液灌流消化約20min后，自心房分段剪取心肌組織，吹打使之分散成單個(gè)細(xì)胞。所有液體均用95%O2+5%CO2飽和，除特殊說明，溫度保持在37±0.5℃。

1.2.2 電生理記錄

應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄[8]單細(xì)胞動(dòng)作電位。

將分離好的單個(gè)心肌細(xì)胞懸液滴加入浴槽中，待細(xì)胞貼壁后，正常臺(tái)氏液3ml·min-1恒速?zèng)_洗至細(xì)胞表面清潔。選擇靜止、桿狀、橫紋清晰、折光性良好的正常心肌細(xì)胞進(jìn)行封接。形成全細(xì)胞構(gòu)型5min后，在電壓鉗模式下記錄膜電流。在正常臺(tái)氏液中，加入5mmol·L-1CsCl取代鉀離子，以排除鉀離子干擾。將保持電壓固定于-40mV（排除鈉電流的干擾），實(shí)驗(yàn)電壓從-30mV以10mV為步階躍至+70mV。在不加氧化苦參堿的情況下，記錄各電壓條件下正常的ICa-L。完成后，給予1μmol·L-1的氧化苦參堿，記錄各電壓條件下的ICa-L。記錄結(jié)束后，用正常的臺(tái)氏液以3m l·min-1沖洗，5min后記錄洗脫后各電壓條件下的ICa-L。

實(shí)驗(yàn)過程由計(jì)算機(jī)軟件pCLAMP9.2（Axon Instrument）控制數(shù)模轉(zhuǎn)換器完成刺激信號(hào)的產(chǎn)生、反饋信號(hào)的采集以及數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)中計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）方式表示，應(yīng)用組間t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，雙尾概率以p<0.01作為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。分析程序用Clampfit8.0。

2 結(jié)果：氧化苦參堿對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞ICa-L的影響

形成全細(xì)胞構(gòu)型后，在電壓鉗模式下記錄電流。在正常臺(tái)氏液中，加入5mmol·L-1CsCl取代鉀離子以排除鉀離子干擾。將保持電壓固定于-40mV（排除鈉電流的干擾），實(shí)驗(yàn)電壓從-30mV以10mV為步階躍至+70mV，測定從0時(shí)開始到刺激結(jié)束時(shí)的300ms電流穩(wěn)態(tài)值。氧化苦參堿1μmol·L-1在各電壓條件下均可增加ICa-L（見圖1）。在實(shí)驗(yàn)電壓+10mV時(shí)，氧化苦參堿使ICa-L從給藥前（-8.03±1.90）pA/pF增加至（-9.93±2.95）pA/pF（n=5，p<0.01），沖洗5min后ICa-L恢復(fù)至（-8.65±1.38）pA/pF（n=5，p<0.01）參堿對(duì)I-V曲線的影響。

圖1 氧化苦參堿對(duì)豚鼠心室肌細(xì)胞L型鈣通道電流的影響>Fig.1 Effectsofoxymatrineon L-type calcium currentof cardiacmyocytes in guinea pigs

（*P<0.01與對(duì)照組相比）

3 討論

近年來，關(guān)于離子通道研究進(jìn)展的深入，推動(dòng)了心律失常診斷和治療。目前，臨床上常用的幾類抗心律失常藥物均存在共同不足，如在治療心律失常時(shí)，往往又誘發(fā)心律失常、傳導(dǎo)阻滯，其發(fā)生率較高。為了彌補(bǔ)西醫(yī)抗心律失常藥物治療的不足，采用中醫(yī)藥辨證施治或采用中成藥治療心律失常研究日漸增多。離體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氧化苦參堿不同濃度可明顯增加蟾蜍、家兔和豚鼠心肌收縮力，心輸出量，并不伴有心率的加快[9]。在血流動(dòng)力學(xué)方面，氧化苦參堿可降低前后負(fù)荷，糾正心衰時(shí)增高的心室舒張期末壓，明顯改善心臟泵血功能[9]。

心肌細(xì)胞具有兩個(gè)主要特征：一是在細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中存在巨大的離子濃度差，二是通過短暫的特異離子通道的開啟和關(guān)閉，可以使細(xì)胞膜去極化，引起一系列的效應(yīng)，包括心肌細(xì)胞的收縮和舒張。其中鈣離子通道扮演了十分重要的角色。心肌細(xì)胞中最主要的有L型和T型兩種鈣離子通道，同屬于電壓依賴性鈣通道，L型鈣離子通道分布于心室肌在內(nèi)的所有心肌細(xì)胞中，其對(duì)平臺(tái)期的形成、細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增多和肌肉收縮期起重要的作用。Ca2+作為心肌興奮收縮偶聯(lián)因子，其參與心衰時(shí)心肌收縮力降低的主要原因即為轉(zhuǎn)運(yùn)失常。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)氧化苦參堿可激活L型鈣通道，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，進(jìn)而可增加心肌收縮力，是具有正性肌力作用的抗心律失常藥物，適用于心功能不全的患者。

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