唐曉旭 丁忠家 王人鳳 施澤濤 邢蔚 閆輝 武瑾 宋勇莉 盧連軍

錳是人體必需的微量元素之一，涉及人體多種生化功能和代謝過程，長期攝入過量錳可導致錳中毒，出現(xiàn)帕金森病樣臨床表現(xiàn)。流行病學調(diào)查表明，長期接觸錳塵的工人可出現(xiàn)聽力下降[1]，但尚不能明確聽力下降是因錳中毒引起抑或環(huán)境噪聲引起。Ding等[2]通過體外試驗，觀察氯化錳對耳蝸的影響，發(fā)現(xiàn)錳可以導致內(nèi)、外毛細胞、外周聽神經(jīng)纖維和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的損傷。本研究擬通過觀察慢性錳中毒對大鼠耳蝸外毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的形態(tài)學及聽功能的影響，進一步探討慢性錳中毒致聽覺損傷的可能機理。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選用雄性斷乳21天SD大鼠60只(第四軍醫(yī)大學動物中心提供)為實驗動物，體重50～70 g，正常飲食，適應性飼養(yǎng)3天后，隨機分為染毒組和正常對照組，每組30只。各組大鼠分籠飼養(yǎng)，所有動物飼以普通飼料，自由飲水和進食，籠具、飲水瓶等所有用具均為非含錳制品。實驗過程中，動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度、濕度、光照強度均符合實驗動物規(guī)范。

1.2實驗的主要試劑和儀器 氯化錳溶液(MnCl2·4H2O)、鬼筆環(huán)肽(FITC-Phalloidin)均購自美國Sigma公司，聽覺腦干監(jiān)測儀(型號RZ6，購自美國TDT公司)，一次性真空采血管(購自西安壯志生物公司)。

1.3氯化錳給藥及血錳濃度檢測方法 染毒組大鼠每日以氯化錳水溶液(MnCl2·4H2O)100 mg·kg-1d-1經(jīng)口灌胃[3]，正常對照組大鼠以等量去離子水灌胃，灌胃液體容量：動物體重小于0.1 kg時為0.5 ml，大于0.1 kg時為1.0 ml；每天一次，連續(xù)灌胃12 w。兩組大鼠實驗期間均自由飲用去離子水，分別于灌胃4 、8 和12 w后抽取大鼠尾血進行血錳濃度檢測(西安地礦中心檢測)。

1.4聽性腦干反應(ABR)檢測 灌胃12 w后兩組大鼠分別進行ABR檢測，測試在屏蔽隔聲室內(nèi)完成。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉；1寸毫針作為電極，記錄電極置于顱頂正中皮下，參考電極置于測試耳耳后皮下，接地電極刺于鼻尖皮下，刺激聲為短純音(tone burst)，刺激聲強度為90 dB SPL由MF1-S立體磁性揚聲器輸出，耳機距動物外耳道口2 cm，掃描時間10 ms，上升下降時間為0.5 ms，間隔時間為45.517 ms，給聲刺激重復率21.97次/秒，濾波帶寬100～3 000 Hz，疊加1 024次，以引出波Ⅲ的最小刺激強度為ABR反應閾。

1.5耳蝸細胞形態(tài)學觀察 完成ABR測試后，分別取兩組大鼠耳蝸行基底膜鋪片觀察、外毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)，透射電鏡下觀察毛細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5.1基底膜鋪片F(xiàn)ITC鬼筆環(huán)肽染色及觀察 各組取大鼠3只，以2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后迅速斷頭，取雙耳聽泡，于圓窗和蝸尖處各刺一小孔，以4%多聚甲醛(pH =7.4)自蝸尖向圓窗灌流，并將耳蝸浸泡在相同的固定液中，放入4 ℃ 冰箱后固定過夜；以0.01 M PBS(pH =7.4)漂洗2 次，再置于10% EDTA 液中浸泡3 d 脫鈣后，在解剖顯微鏡下行耳蝸基底膜全層剝離并置于0.3 % TritonX- 100 去污劑浸泡30 min，經(jīng)0.01 M PBS 漂洗后放入1% 正常牛血清白蛋白封閉 30 min后用FITC-phalloidin(1：60) 避光37 ℃ 孵育30 min，0.01 M PBS 漂洗，鋪平、甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5.2全耳蝸外毛細胞計數(shù) 耳蝸基底膜鋪片染色后于400 倍的熒光顯微鏡下，以目鏡中實際長度為0.24 mm 的顯微測微尺為基本單位，將經(jīng)FITC-phalloidin 熒光染色的基底膜從蝸頂向蝸底逐個視野依次進行外毛細胞計數(shù)，將計數(shù)的數(shù)據(jù)輸入到全耳蝸毛細胞定量分析系統(tǒng)中，對于外毛細胞大部分缺失的基底膜，只計數(shù)存活細胞數(shù)；而外毛細胞大部分存活的基底膜樣品中，只計數(shù)缺損的外毛細胞數(shù)；若外毛細胞全部壞死，則計數(shù)為零；若機械損壞導致外毛細胞損傷，則輸入Bad，系統(tǒng)可自動按缺失值處理。經(jīng)軟件分析后，毛細胞數(shù)量均轉(zhuǎn)換為百分比形式，并生成該耳蝸基底膜的外毛細胞定量分析圖譜。

1.5.3螺旋神經(jīng)節(jié)細胞染色及計數(shù) 兩組各取5只大鼠的耳蝸，將固定的切片經(jīng)蘇木精液染色數(shù)分鐘后，用稀鹽酸乙醇溶液分色，然后浸入1%伊紅染液染5～10 min，再經(jīng)70%乙醇分色，系列乙醇脫水，直至胞質(zhì)與胞核的紅藍反差鮮明。目鏡加網(wǎng)格片，每小格在40×10放大倍數(shù)下覆蓋面積為10×10 μm，切片厚度4 μm，每隔4張切片記錄一張切片的螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)，將記錄到的螺旋神經(jīng)節(jié)細胞總數(shù)取其平均值[4]。

1.5.4透射電鏡標本制備及觀察 兩組各取5只大鼠完成ABR測試后灌注、處死，取左側(cè)耳蝸，在解剖顯微鏡下去除骨性外殼及血管紋，4%戊二醛固定2 h以上，緩沖液漂洗15 min×2次，1%四氧化鋨固定2 h，緩沖液漂洗15 min×2次；梯度丙酮脫水，丙酮+混合包埋液(1：1)包埋，60 ℃孵箱聚合24 h；1 μm半薄切片，甲苯胺藍染色，修塊、定位，鉛、鈾各復染10 min，透射電鏡 (JEM-1230，日本)觀察。

1.6統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料用重復測量設計資料的方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠血錳濃度比較 兩組大鼠灌胃4 、8 及12 w后血錳濃度見表1，可見染毒組三個時間點血錳濃度顯著高于對照組(均為P<0.01)，且染毒組血錳濃度隨染毒時間延長逐漸增高，其第8 w的血錳濃度明顯高于第4 w(P<0.05)，第12 w血錳濃度明顯高于第8 w(P<0.05)。

表1 兩組大鼠灌胃4、8和12 w后平均血錳濃度比較

注：* 與對照組比較，P<0.01；# 與同組第4 w比較，P<0.05；△ 與同組第8 w比較,P<0.05

2.2灌胃12 w后兩組大鼠ABR反應閾比較 兩組大鼠灌胃12 w后ABR反應閾見表2。對照組ABR平均反應閾為20.5±2.1 dB SPL，染毒組平均反應閾為46.32±10.6 dB SPL，染毒組各頻率ABR反應閾均明顯高于對照組(均P<0.05)，其中以高頻提高最為顯著。

表2 灌胃12 w后兩組大鼠各頻率ABR反應閾

注：* 與對照組比較，P<0.05

2.3兩組大鼠耳蝸外毛細胞形態(tài)及缺失率比較 對照組頂、中和底回外毛細胞均排列整齊，纖毛方向一致呈V或W型；染毒組底回外毛細胞出現(xiàn)明顯缺失，頂回和中回病變較輕(圖1)。對照組和染毒組基底膜外毛細胞的缺失率分別為0.33%和7.33%，染毒組缺失率明顯高于對照組(P<0.05) 。

2.4兩組大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)形態(tài)及計數(shù)比較 對照組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞清晰可見，排列整齊；染毒組部分螺旋神經(jīng)節(jié)細胞核型不完整，細胞出現(xiàn)空泡樣變(圖2)。對照組與染毒組大鼠平均螺旋神經(jīng)節(jié)細胞總數(shù)分別為16 873.45±475.76及14 774.38±256.58個，染毒組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞較對照組明顯減少(P<0.05)。

2.5兩組大鼠基底膜毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞透射電鏡觀察結(jié)果 對照組耳蝸毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞核圓，核仁明顯，細胞質(zhì)豐富，可見大量的線粒體透光度均勻，形態(tài)規(guī)則，含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體，細胞器結(jié)構(gòu)清晰，線粒體嵴致密清楚；而染毒組毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞核型稍不規(guī)則，核膜周邊有少量異染色質(zhì)聚集，部分線粒體嵴消失或斷裂，呈空泡樣改變，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞線粒體尚可見髓樣改變(圖3、4)。

3 討論

錳是人體必需的微量元素，攝入不足或過度均可導致機體損害。動物錳攝入不足可出現(xiàn)各種各樣的結(jié)構(gòu)和功能缺陷，包括生長延遲、骨與軟骨畸形、內(nèi)耳及視神經(jīng)發(fā)育異常[5]。錳中毒常見于采礦、冶煉和從事電焊作業(yè)的工人，職業(yè)性錳暴露引起中毒的原因可能與錳暴露的持續(xù)時間、濃度、頻率以及進入體內(nèi)的途徑有關。近年來， 隨著錳越來越廣泛的使用，其對人類健康的危害也越來越受到重視，成年個體錳中毒早期主要表現(xiàn)為神經(jīng)毒性，繼而出現(xiàn)明顯的錐體外系神經(jīng)受損癥狀，與帕金森病癥狀類似[6]；除了神經(jīng)系統(tǒng)外，慢性錳中毒還可能引起聽覺系統(tǒng)的損害。以往文獻提示，無論單獨的長期錳暴露或同時伴有強噪聲暴露，均可出現(xiàn)聽力損害[7～9]。

圖1 兩組大鼠耳蝸底回基底膜鋪片 a：對照組，b：染毒組， OHC：外毛細胞，IHC：內(nèi)毛細胞，紅星示外毛細胞缺失(FITC染色)(Scale bar: 20μm)

圖3 兩組大鼠基底膜毛細胞透射電鏡觀察結(jié)果

a：對照組毛細胞核圓，核仁明顯，細胞質(zhì)豐富，細胞器結(jié)構(gòu)清晰； b：對照組毛細胞線粒體透光度均勻，形態(tài)規(guī)則，可見豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體，線粒體嵴致密清楚；c：染毒組毛細胞核型稍不規(guī)則，核膜周邊有少量異染色質(zhì)聚集；d：染毒組毛細胞線粒體腫脹，嵴減少或消失，黑色箭頭示空泡樣變

圖4 兩組大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細胞透射電鏡觀察結(jié)果

a：對照組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞核圓，核仁明顯，細胞胞質(zhì)豐富，細胞器結(jié)構(gòu)清晰；b：對照組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞線粒體透光度均勻，形態(tài)規(guī)則，線粒體嵴致密清楚；c：染毒組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞核型稍不規(guī)則，核膜周邊有少量異染色質(zhì)聚集；d：染毒組螺旋神經(jīng)節(jié)細胞線粒體腫脹、嵴消失或斷裂，空泡樣改變，黑色箭頭示髓樣結(jié)構(gòu)

本研究結(jié)果顯示染毒組動物的血錳濃度隨染毒時間延長而逐漸增高，在灌胃12 w后，其ABR平均反應閾明顯高于正常對照組，尤以高頻區(qū)改變最明顯，證明慢性錳中毒可以導致大鼠聽損傷。從文中結(jié)果看，慢性錳中毒可導致大鼠的耳蝸外毛細胞缺失，其中以耳蝸底回外毛細胞缺失最為明顯，提示了大鼠慢性錳中毒主要出現(xiàn)高頻聽力損失的原因。

研究表明，錳的神經(jīng)毒性與多巴胺耗竭、自由基的產(chǎn)生、線粒體損傷和鈣穩(wěn)態(tài)失衡等因素有關[10]，但目前尚不清楚慢性錳中毒導致聽損傷的確切機制。Me等[11]通過全身給予小鼠氯化錳后，發(fā)現(xiàn)氯化錳在內(nèi)耳聚集，提示錳暴露后，吸收至體內(nèi)的錳可以進入內(nèi)耳，并進一步證實小鼠內(nèi)耳血管內(nèi)皮細胞中金屬轉(zhuǎn)運體的存在，血液中的錳離子可以被金屬轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運至內(nèi)耳；在新生大鼠耳蝸器官培養(yǎng)條件下，氯化錳可以導致感覺毛細胞、外周聽覺神經(jīng)纖維和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞明顯損害，證實錳具有耳毒性[12]。研究顯示[2]錳的濃度在微摩爾水平即可表現(xiàn)出耳毒性，且損害程度呈劑量依賴性，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞較感覺毛細胞敏感，耳蝸底回的外毛細胞較頂回的敏感。線粒體是細胞能量代謝的場所，錳對線粒體具有特殊的親和力，錳中毒后錳離子聚集最多的亞細胞器就是線粒體，目前認為線粒體形態(tài)的改變是錳誘導細胞損傷的早期表現(xiàn)[12～14]。Malecki等[15]在研究錳對大鼠原代紋狀神經(jīng)元的影響中，發(fā)現(xiàn)錳毒性與線粒體功能失調(diào)、自由基產(chǎn)生及DNA斷裂有關，提示錳中毒可以誘導凋亡性細胞死亡。Tamm[16]采用鼠源性神經(jīng)干細胞系和大鼠胚胎原代神經(jīng)干細胞研究錳對神經(jīng)發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞對錳高度敏感，并可通過激活線粒體caspase介導的通路，誘導干細胞發(fā)生凋亡，同時還證實氧化應激在錳誘導神經(jīng)干細胞死亡中發(fā)揮至關重要的作用。從本研究透射電鏡觀察結(jié)果可見，慢性錳中毒可導致耳蝸外毛細胞和螺旋神經(jīng)元線粒體形態(tài)發(fā)生改變，包括線粒體嵴消失或斷裂、空泡樣變，可能與螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡有關。

綜上所述，慢性錳中毒通過損傷耳蝸毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞引起大鼠聽力下降。由于本研究采用的染毒劑量和中毒時間比較單一，因此研究結(jié)果很可能具有局限性。對于慢性錳中毒對聽力影響的染毒劑量、染毒時間與效應的關系以及慢性錳中毒損害聽力的發(fā)病機制等，還有待于今后更深入的研究。

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