楊潤(rùn)琴 梁媛媛 鄧志宏

成體干細(xì)胞的增殖及定向分化能力是組織器官再生修復(fù)的基礎(chǔ)[1]。已有研究表明炎癥能夠影響成體干細(xì)胞的增殖和分化，如抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)和牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)的多向分化，促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue-derived stromal cells，ADSCs)和神經(jīng)元祖細(xì)胞(neural progenitor cells，NPCs)的增殖[2～6]。因此炎癥對(duì)成體干細(xì)胞在組織再生修復(fù)中的應(yīng)用效果有極大影響，其對(duì)成體干細(xì)胞增殖和分化的影響將致其修復(fù)組織再生的能力發(fā)生改變。聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞(vocal fold mesenchymal stem cells, VF-MSCs)是分離聲帶黏膜組織獲得的成體干細(xì)胞，是分泌聲帶固有層細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)成分的主要細(xì)胞[7～9]。聲帶固有層ECM有序化排列是聲帶振動(dòng)的基礎(chǔ)，而聲帶炎性疾病可致ECM的排列紊亂，引起瘢痕攣縮[10～12]。聲帶息肉、任克水腫和接觸性肉芽腫等疾病具有炎性病變的特征[13]，故本實(shí)驗(yàn)選取聲帶息肉(水腫型)并伴聲帶炎性病變的手術(shù)標(biāo)本作為炎性聲帶組織，研究炎癥對(duì)VF-MSCs生物學(xué)行為影響，以期為炎癥損傷聲帶的修復(fù)提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1組織來(lái)源 實(shí)驗(yàn)所用的組織均來(lái)源于第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科手術(shù)標(biāo)本，正常組織來(lái)源于下咽癌行喉全切除術(shù)后的正常聲帶組織，炎癥組織來(lái)源于聲帶息肉(水腫型)患者切除的標(biāo)本，所取組織大小約1 mm×1 mm，每種組織3例，均為男性，年齡均為35～55歲，供體無(wú)任何傳染病及內(nèi)分泌疾病，術(shù)前征得患者本人同意簽字并報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1組織學(xué)行為檢測(cè) HE染色：所取組織經(jīng)清水反復(fù)清洗后，4%多聚甲醛固定過(guò)夜，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并連續(xù)切片，厚度約5 μm，分別用蘇木精染色5 min和0.5%伊紅染色1 min后中性樹(shù)膠固定封片。

聲帶組織切片經(jīng)Masson三色染色后，膠原纖維可著藍(lán)色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，紅細(xì)胞呈紅色。參照Weigert鐵蘇木素試劑盒(貝索)使用說(shuō)明書(shū)，A液和B液等比例混合，滴染切片10 min，流水稍洗，1%鹽酸酒精分化1 s，麗春紅酸性品紅染液染5 min，流水稍沖洗，磷鉬酸溶液處理約5 min，不用水洗直接用苯胺藍(lán)染液復(fù)染5 min，1%冰醋酸處理1 min，酒精脫水并用二甲苯透明后，中性樹(shù)膠封固。

Elastin Van Gieson(EVG)染色：EVG染色后可使聲帶組織固有層中彈性纖維及細(xì)胞核著藍(lán)黑色，膠原纖維紅染。參照EVG染色試劑盒(貝索)，將脫蠟水化后的切片用70%乙醇稍沖洗后，浸入Victoria Blue’B染色液(0.5g Victoria Blue’B溶于100ml 70%乙醇)15 min，95%乙醇分化后蒸餾水洗2次，用Ponceau染色液(0.5%麗春紅水溶液10 ml混于苦味酸飽和水溶液85 ml)滴染5 min，無(wú)水乙醇分化脫水、二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片。

1.2.2細(xì)胞分離培養(yǎng)和免疫熒光染色 細(xì)胞分離培養(yǎng)：參照文獻(xiàn)[7,8]，將聲帶黏膜組織用PBS清洗干凈后，除去血液肌肉組織，用眼科剪將組織剪碎，置于離心管中離心后加入Dipase酶(Gibco BRL)，在含5% CO2、37 ℃及飽和濕度的孵箱中消化30 min,體式顯微鏡下撕脫消化下來(lái)的上皮細(xì)胞,將余下的組織剪成后乳糜狀并加入I型膠原酶(Gibco BRL)消化30 min，加入含有α-MEM(Gibco BRL)的大瓶中，置于含5% CO2、37 ℃及飽和濕度的孵箱，每3 d換液一次，細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)用胰蛋白酶消化傳代，本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為第3代細(xì)胞。

細(xì)胞免疫熒光染色：檢測(cè)所培養(yǎng)細(xì)胞是否表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物Stro-1，制備細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后4%多聚甲醛固定，0.25%的triton孵育15min，PBS洗3次，3% H2O2浸泡15 min，羊血清孵育30 min，加入一抗(小鼠抗人Stro-1，1:100，Biolegend) ，37 ℃孵育2 h，避光加入熒光二抗，37 ℃孵育1 h，PBS清洗3次，吸干殘液，Hochest襯染核2 min，甘油封片后在熒光顯微鏡下照相。

1.2.3細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：將1 000個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至100 mm培養(yǎng)皿中，連續(xù)培養(yǎng)14 d，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3遍后，多聚甲醛固定10 min，甲苯胺蘭染色30 min，PBS洗3遍后顯微鏡下觀察并拍照，含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落作為一個(gè)克隆計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率。

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液 (1×105個(gè)/m1)，200 μl細(xì)胞懸液加入96孔板，分別于接種1～7 d后每孔加入20 μl MTT溶液, 孵育4 h后棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜，振蕩5 min后酶標(biāo)儀測(cè)490 nm吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4細(xì)胞分化能力檢測(cè) 成脂分化實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿90%時(shí)，分別加入2 ml成脂誘導(dǎo)液，10%胎牛血清，2 μM 吲哚美辛，0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，10 nM地塞米松(均購(gòu)自Sigma)，每3 d 換液一次。成脂誘導(dǎo)分化14 d 后，0.3% 油紅O染色30 min，PBS洗3次，拍照后每孔中加入1 ml Tris-HCl，室溫放置15 min，將150 μl混合溶液移入96孔板，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)520 nm處吸光值。

成骨分化實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁并長(zhǎng)滿90%時(shí)，加入成骨誘導(dǎo)液，10%胎牛血清，5 mM β-磷酸甘油鈉，100 nM 地塞米松，50 μg/ml 維生素C(均購(gòu)自Sigma)，每3 d 換液一次。成骨誘導(dǎo)分化21 d 后，棄去誘導(dǎo)液，PBS洗3次后4%多聚甲醛固定10 min，0.1% 茜素紅染色30 min，PBS洗3次，倒置顯微鏡下觀察并拍照后每孔中加入十六烷基吡啶孵育15 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)560 nm處吸光值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分別取經(jīng)Masson三色和EVG染色的切片，炎癥組和正常組各取3張，每張切片分別取3個(gè)視野，顯微鏡200倍視野觀察固有層膠原纖維和彈力纖維分布情況并拍照，通過(guò)Image Pro Plus 5.0(IPP) 軟件分析計(jì)算膠原纖維和彈力纖維的累積光密度值(IOD)，各成分含量由其顏色的深淺、所占面積的大小決定，顏色越淺、面積越小，IOD越小。采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1組織學(xué)行為觀察 聲帶石蠟切片HE染色可見(jiàn)聲帶組織結(jié)構(gòu)由淺至深為上皮層，固有層和肌層。其中，正常聲帶組織結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞排列整齊。炎性聲帶組織較正常聲帶組織上皮層增厚，鱗狀上皮細(xì)胞呈覆層生長(zhǎng)，上皮下固有層局部有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增生(圖1)。

Masson三色染色結(jié)果顯示，正常聲帶組織固有層中膠原纖維無(wú)明顯增粗且排列整齊，炎性聲帶組織固有層中膠原纖維增粗且排列紊亂，IPP軟件定量分析結(jié)果顯示炎癥組膠原纖維含量(1.15±0.13)較正常組(0.53±0.02)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

EVG染色結(jié)果顯示，炎癥聲帶組織固有層中彈性纖維較正常變細(xì)，分布減少，也可見(jiàn)膠原纖維較正常增粗，分布較多且排列紊亂。IPP軟件定量分析結(jié)果顯示炎癥組彈性纖維含量(0.64±0.03)較正常組(1.47±0.23)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

2.2VF-MSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光染色 慢性炎性組織來(lái)源的聲帶間充質(zhì)干細(xì)胞(inflammatory vocal fold mesenchymal stem cells,I-VF-MSCs)和正常聲帶組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(normal vocal fold mesenchymal stem cells,N-VF-MSCs)均可貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)均呈長(zhǎng)梭樣，胞核較大，呈橢圓形。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物Stro-1免疫熒光染色后，可見(jiàn)Stro-1在I-VF-MSCs和N-VF-MSCs均有表達(dá)(圖4)。

2.3細(xì)胞增殖能力的比較 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，I-VF-MSCs和N-VF-MSCs均具有細(xì)胞克隆形成能力，且I-VF-MSCs克隆形成能力高于N-VF-MSCs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5a)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，I-VF-MSCs和N-VF-MSCs均具有增殖能力，3 d時(shí)細(xì)胞均處于快速生長(zhǎng)期，6 d后細(xì)胞增殖速率變慢，進(jìn)入平臺(tái)期，且I-VF-MSCs生長(zhǎng)曲線高于N-VF-MSCs，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5b)。

2.4細(xì)胞分化能力的比較 細(xì)胞中加入成脂誘導(dǎo)液后，細(xì)胞形態(tài)變長(zhǎng)，有部分細(xì)胞死亡，N-VF-MSCs和I-VF-MSCs分別于誘導(dǎo)7 d和10 d后有少量空泡樣脂滴生成，誘導(dǎo)14 d后脂滴數(shù)量增加，呈串珠樣，行油紅O染色，可見(jiàn)N-VF-MSCs中著紅染的串珠樣脂滴多于I-VF-MSCs，進(jìn)行定量示N-VF-MSCs組吸光度值(0.62±0.04)高于I-VF-MSCs組(0.13±0.01)(P<0.05)(圖6a、b)。

細(xì)胞中加入成骨誘導(dǎo)液后，細(xì)胞有少量死亡，誘導(dǎo)10 d后細(xì)胞呈旋渦狀大量密集，細(xì)胞形態(tài)變細(xì)變長(zhǎng)，N-VF-MSCs和I-VF-MSCs分別于誘導(dǎo)14 d和18 d后有少量礦化結(jié)節(jié)生成，后逐漸增多，至21 d時(shí)加入茜素紅染色，礦化結(jié)節(jié)著紅色，鏡下可見(jiàn)N-VF-MSCs中著紅色的礦化結(jié)節(jié)多于I-VF-MSCs，該脂滴在結(jié)節(jié)檢測(cè)吸光度值，N-VF-MSCs組吸光度值(0.57±0.04)高于I-VF-MSCs組(0.21±0.02)(P<0.05)(圖6c、d)。

3 討論

分離培養(yǎng)聲帶黏膜組織可獲得VF-MSCs，其與聲帶組織的再生修復(fù)密切相關(guān)，可分泌膠原纖維，彈力纖維等固有層內(nèi)ECM成分。其中，膠原纖維為組織提供結(jié)構(gòu)和力量，受力時(shí)可承受壓力、抵抗變形，彈性纖維賦予組織彈性，與聲帶變形和回復(fù)等聲帶特性相關(guān)[6,14]。炎癥是體內(nèi)影響成體干細(xì)胞功能的重要因素，其可影響成體干細(xì)胞的增殖和分化能力[2～6,15]。研究炎癥對(duì)VF-MSCs增殖和分化能力的影響，可為炎性聲帶損傷修復(fù)奠定一定的理論基礎(chǔ)。

圖1 聲帶組織切片HE染色圖片(a為正常組，b為炎癥組)(×200)圖2 聲帶組織切片Masson三色染色圖片(a為正常組，b為炎癥組)(×200)

圖3 聲帶組織切片EVG染色圖片(a為正常組，b為炎癥組)(×200)

圖4 VF-MSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察膠原染色圖片 a、b為VF-MSCs原代培養(yǎng)(×100)，c、d為Stro-1免疫熒光染色(×200)

圖5 VF-MSCs克隆形成率(a)和MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(b)

圖6 VF-MSCs成脂誘導(dǎo)分化油紅O染色(a、b)和成骨誘導(dǎo)分化茜素紅染色(c、d)(×100)

本研究對(duì)炎性和正常聲帶組織行HE、Masson三色及EVG染色，以觀察炎性聲帶組織固有層內(nèi)ECM的改變情況，結(jié)果顯示，炎性聲帶組織上皮層較正常組增厚，固有層局部有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性聲帶組織中彈性纖維較正常組變細(xì)，膠原纖維排列紊亂且含量增多，表明炎癥引起聲帶固有層ECM的彈性纖維含量減少和膠原纖維含量增加、排列紊亂，損害ECM的成分和有序化排列改變，致炎性聲帶組織較正常聲帶組織彈性減弱，抗壓力增強(qiáng)，引起聲帶振動(dòng)功能減弱[15～17]。

有研究認(rèn)為炎性細(xì)胞的過(guò)度增殖既是慢性炎癥的病理特征，又是其發(fā)病機(jī)制的始動(dòng)因素[18]。在正常情況下，干細(xì)胞增殖處于相對(duì)靜止的狀態(tài)，當(dāng)炎性因素刺激時(shí)，干細(xì)胞會(huì)進(jìn)入瞬時(shí)擴(kuò)增狀態(tài)。本研究用消化法分離培養(yǎng)炎癥和正常聲帶黏膜組織獲得VF-MSCs，見(jiàn)原代細(xì)胞均可貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，胞核較大；用間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物Stro-1對(duì)細(xì)胞行免疫熒光染色，可見(jiàn)N-VF-MSCs和I-VF-MSCs 均可表達(dá)Stro-1；用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，I-VF-MSCs細(xì)胞增殖能力較N-VF-MSCs增強(qiáng)，表明炎癥促進(jìn)VF-MSCs增殖。

有研究證實(shí)炎癥微環(huán)境中炎性因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α， TNF-α)激活Wnt通路而引起間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力的下降，而抑制Wnt通路可調(diào)節(jié)炎癥對(duì)成骨和成脂分化能力的影響[19，20]。本研究將細(xì)胞定向向成脂、成骨細(xì)胞方向分化，以比較炎癥對(duì)VF-MSCs多向分化能力的影響，結(jié)果顯示，N-VF-MSCs中著紅染的脂滴較I-VF-MSCs多，I-VF-MSCs中著紅色的礦化結(jié)節(jié)較N-VF-MSCs少，表明炎癥抑制VF-MSCs向成脂、成骨細(xì)胞方向分化。

本實(shí)驗(yàn)為炎癥損傷聲帶后固有層內(nèi)ECM的變化及炎癥對(duì)VF-MSCs增殖及分化能力的影響提供了一定的依據(jù)，為今后逆轉(zhuǎn)炎性損傷聲帶組織奠定了一定的基礎(chǔ)。關(guān)于如何逆轉(zhuǎn)炎性疾病損傷聲帶固有層內(nèi)ECM及對(duì)VF-MSCs的影響，將是我們今后研究工作的一個(gè)重點(diǎn)。

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