李書華，陳婷婷，劉諭昆，李灝，陳藝瑛，張雅潔

臨床研究

重組腺病毒載體pDCpDC316316-hIL
--hIL-2424的構(gòu)建及病毒滴度測(cè)定

李書華，陳婷婷，劉諭昆，李灝，陳藝瑛，張雅潔

廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東廣州510182

目的構(gòu)建重組腺病毒載體pDC316-hIL-24，并測(cè)定病毒滴度。方法從HEK293細(xì)胞中提取mRNA，設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò)RT-PCR法擴(kuò)增hIL-24基因全編碼區(qū)序列。將測(cè)序正確的片段用BglⅡ和HindⅢ雙酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭質(zhì)粒中。構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-hIL-24，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下與腺病毒輔助大質(zhì)粒pBHGlox（delta）E1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組腺病毒pDC316-hIL-24，經(jīng)HEK293細(xì)胞擴(kuò)增，TCID50法測(cè)定重組腺病毒滴度。結(jié)果成功構(gòu)建出表達(dá)hIL-24基因的重組腺病毒載體（pDC316-hIL-24），獲得了高滴度表達(dá)hIL-24基因的重組腺病毒。結(jié)論重組腺病毒表達(dá)載體（pDC315-hIL-24）的成功構(gòu)建及重組腺病毒的獲得有利于進(jìn)一步開展腫瘤的轉(zhuǎn)基因治療研究。

hIL-24；重組腺病毒載體；病毒滴度；pDC316-hIL-24

hIL-24是由哥倫比亞大學(xué)Jiang等［1］于1995年從人黑色素瘤細(xì)胞HO-1中分離獲得的一種新基因，現(xiàn)在又命名為黑色素瘤分化相關(guān)基因-7（mda-7）。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)該基因還能促進(jìn)其他多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌等，并可抑制血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。相對(duì)于其它抗腫瘤基因，hIL-24是唯一的具有殺死腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有任何毒性作用的細(xì)胞因子［2-5］，從而具有極大的臨床抗腫瘤應(yīng)用價(jià)值。

AdMax包裝系統(tǒng)是由Frank教授建立的重組腺病毒表達(dá)載體，通過(guò)AdMax包裝系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒，具有操作簡(jiǎn)便、重組效率高、獲得的病毒產(chǎn)率高而且目的基因的表達(dá)水平高等特點(diǎn)，因而已逐漸代替目前最普及的AdEasy系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建含人hIL-24基因的重組腺病毒pDC316-hIL-24表達(dá)載體，擴(kuò)增表達(dá)hIL-24基因的重組腺病毒，通過(guò)感染腫瘤細(xì)胞并大量表達(dá)hIL-24蛋白，為進(jìn)一步觀察hIL-24基因抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)

1 材料和方法

1.1 腺病毒和細(xì)胞株

AdMax重組腺病毒載體系統(tǒng)［包括穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP以及E1、E3區(qū)缺失的5型腺病毒輔助大質(zhì)粒pBHG loxΔE1，3Cre］購(gòu)自加拿大Microbix。HEK293細(xì)胞及A549肺腺癌細(xì)胞株購(gòu)為廣州醫(yī)科大學(xué)病理教研室保存質(zhì)粒，PMD-18-T購(gòu)自TAKARA。

1.2 主要試劑

低相對(duì)分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Takara威佳生物工程公司，限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BglⅡ快速連接試劑盒（DNA ligation kit）購(gòu)于New England Biolabs；質(zhì)粒小樣提取試劑盒（QIAprep MiniprepSystem）、膠回收試劑盒（QIAquick Gel Extraction）及PolyFect Transfection Reagent為Qiagen的產(chǎn)品；1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清均為美國(guó)Gibco產(chǎn)品。

1.2.1 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)及總RNA的提取采用DMEM培養(yǎng)液及10％FBS常規(guī)培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，每2 d換液傳代。取1×106/ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞提取總RNA，按TRIZOL RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成取RNA 1 μg，Oligo DT 1 μg，然后加入10×RAV-2 Reverse Transcriptaseuffer 2 μl，l RNase inhibitor 1 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 L，l和DEPCH2O 5.4 Ll。反應(yīng)總體積為20 μl，l混勻放置于30℃10 min，50℃30 min，99℃5 min，5℃5 min，最后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增hIL-24基因全編碼區(qū)(cDNA)序列參考GenBank NM006850序列設(shè)計(jì)引物，引物含hIL-24基因全編碼區(qū)。上游引物：5'-CG AGATCTATGAATTT'TCAACAGAGGCTG-3'下游引物：5'-CCC GGATCCTTATCAGAGCTTTAGAATT-3'。引物由廣州瑞真生物工程公司合成。上下游引物兩端分別加有BglⅡ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段大小為621 bp，包含完整的IL-24基因cDNA。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收目的片段。

1.2.4 hIL-2基因序列測(cè)定及酶切鑒定將hIL-24基因用T4Ligase連接于PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)菌，用X-gal和IPTG進(jìn)行藍(lán)白篩選，挑選白色陽(yáng)性克隆搖菌，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定后送測(cè)序。

1.2.5 重組pDC316-EGFP-IL-4腺病毒載體的構(gòu)建用BglⅡ和HindⅢ內(nèi)切酶同時(shí)對(duì)腺病毒載體pDC316-EGFP和hIL-24片段進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收；將回收的載體片段和目的基因cDNA用T4Ligase 16℃連接過(guò)夜，直接取5 μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)菌，用含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，挑出3個(gè)克隆，搖菌過(guò)夜，抽提質(zhì)粒、雙酶切鑒定正確的重組腺病毒載體命名為pDC316-EGFP-hIL-24。

1.2.6 重組腺病毒pDC316-hIL-24的包裝用質(zhì)粒抽提試劑盒提取病毒包裝系統(tǒng)中的質(zhì)粒DNA，以紫外光吸收法測(cè)定其濃度及純度后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)程［6-10］。將穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-hIL-4和輔助質(zhì)粒pBHGlox （delta）E1，3Cre通過(guò)Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)，收集細(xì)胞，-70℃/ 37℃反復(fù)凍融，收集病毒上清-70℃保存。

1.2.7 重組腺病毒pDC315-hIL-24的擴(kuò)增、純化將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞4倍稀釋后轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入重組腺病毒pDC315-hIL-24收獲的粗提液繼續(xù)培養(yǎng)，待大部分細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE，收集病毒上清液，再次擴(kuò)增，將混懸液3000 r/min離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用Tris緩沖液重懸，反復(fù)凍融3次，6000 r/min離心，取上清，用DNase酶消化后，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行柱純化，-70℃保存。

1.2.8 重組腺病毒pDC315-hIL-24感染性滴度（TCID50）測(cè)定在離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1~10-10。將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100μl。在每孔加入細(xì)胞懸液100μl，使細(xì)胞量達(dá)到3×105/ml。將96孔板置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 d后觀察細(xì)胞病變現(xiàn)象，并對(duì)CPE孔進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每行的陽(yáng)性率。病毒滴度計(jì)算按（Karber法）：滴度T＝101+d（s-0.5）進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增hIL-24基因cDNA及序列測(cè)定

RT-PCR擴(kuò)增hIL-24基因cDNA片段，用1％瓊脂糖凝膠電泳觀察，在621 bp處可見(jiàn)目的基因片段（圖1），擴(kuò)增出的片段與預(yù)計(jì)目的片段大小一致。將回收的目的片段連接到PMD18-T載體，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)克隆的序列完全正確（圖2）。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Identification the hIL-24 gene by PCR, 1:hIL-24；2:DNAMARKER

2.2 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316-EGFP-hIL-24的酶切鑒定

構(gòu)建出的pDC316-EGFP-hIL-24重組質(zhì)粒用HinglⅡ和HindⅢ雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳觀察，發(fā)現(xiàn)在621 bp和3.9 kb處分別可見(jiàn)目的基因和載體條帶，表明hIL-24基因已正確構(gòu)建到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，見(jiàn)圖3。

圖2 PMD18-T-hIL-24測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequence of PMD18-T-hIL-24 DNAdectection.

圖3 pDC316-EGFP-hIL-24質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ及HindⅢ雙酶切Fig.3Identification the pDC316-EGFP-hIL-24 byBglII andHindIII enzyme.1:pDC316-EGFP-hIL-24,2:DNAMarker.

2.3 重組腺病毒的構(gòu)建

線性化重組穿梭質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒pBHGlox（delta） E1，3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后，在倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）：明顯增大、呈球形，細(xì)胞核變大，變圓，貼壁能力下降而易脫落。第7天出現(xiàn)明顯病毒噬斑（圖4），提示腺病毒構(gòu)建成功并在HEK293細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。

圖4 出現(xiàn)CPE反應(yīng)的293細(xì)胞Fig.4 293 Cells with a CPE response(Original magnification:×10).

2.4 重組腺病毒的鑒定

通過(guò)凍融法裂解細(xì)胞后，收取病毒液并感染HEK293細(xì)胞72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光，發(fā)生同源重組的病毒，可見(jiàn)報(bào)告基因綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)（圖5），提示重組腺病毒感染細(xì)胞并HEK293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)。收取病毒液進(jìn)行PCR鑒定結(jié)果顯示：取病毒DNA1 μl為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出約621 bp的特異性片段，其大小與陽(yáng)性對(duì)照相符，表明mda-7/IL-24基因已克隆入重組腺病毒（圖6，7）。

圖5 pDC316 hIL-24的表達(dá)的綠色熒光蛋白Fig.5 Identification of gfp(O riginal magnification:×100).

圖6 Ad.mda-7.egfp的PCR鑒定Fig.6 identification of Ad.mda-7.egfp by PCR M:DNAMarker 2000;1:PCR positive.

圖7 Ad.IL-24.egfp圖譜Fig.7 Plasmid map of Ad.IL-24.egfp.

2.5 重組腺病毒滴度測(cè)定

收集產(chǎn)生感染性重組病毒顆粒的HEK293細(xì)胞，在37℃/-80℃條件下反復(fù)凍融3次，離心沉淀后，取部分病毒上清再次感染HEK293細(xì)胞以擴(kuò)增重組病毒。如此反復(fù)進(jìn)行多次可獲得高滴度的重組腺病毒。TCID50法測(cè)定所得病毒滴度為2.5×1010U/ml。

3 討論

白細(xì)胞介素24（hIL-24）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型腫瘤抑制基因，現(xiàn)在又命名為黑色素瘤分化相關(guān)基因-7 （mda-7）。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)該基因還能促進(jìn)其他多種癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡，如卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌等。相對(duì)于其它抗腫瘤基因，hIL-24在抗瘤抑瘤及降低毒副作面用兩具有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，hIL-24的抗腫瘤具備惡性腫瘤選擇性。該基因?qū)φ１砥ぜ?xì)胞，肺成纖維細(xì)胞，乳腺細(xì)胞，前列腺和肺上皮細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞及黑色素細(xì)胞等正常細(xì)胞均無(wú)任何毒副作用；其次，hIL-24用于癌癥治療不受腫瘤細(xì)胞的抑癌基因狀態(tài)的影響，相對(duì)于p53等抑癌基因來(lái)說(shuō)，hIL-24抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡與這些癌細(xì)胞中其它抑癌基因的狀態(tài)無(wú)關(guān)(p53，Rb，或pl6ink4)，因而可以更穩(wěn)定地發(fā)揮抗腫瘤作用；同時(shí)，hIL-24是一個(gè)前Thl因子(pro-Thlcytokine)，能激活STAI產(chǎn)生腫瘤免疫，抗血管生成和受體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性［6-8］；最后，hIL-24蛋白還可以大大增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性，從而起到殺傷腫瘤細(xì)胞的效果。hIL-24是IL-10家族中唯一的具有殺死腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有任何毒性作用的細(xì)胞因子［2-4］，從而具有極大的臨床抗腫瘤應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)采用的pDC316載體屬于腺病毒AdMax，構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體代替最普及的AdEasy系統(tǒng)。AdMax包裝系統(tǒng)是由Frank教授建立，由加拿大Microbix公司經(jīng)銷。與目前使用最普及的腺病毒AdEasy系統(tǒng)相比，腺病毒AdMaxTM系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)便、重組效率高、獲得的病毒產(chǎn)率高（一般大于104 vp/ cell）、目的基因的表達(dá)水平高（因?yàn)閙CMV啟動(dòng)子比hCMV啟動(dòng)子強(qiáng)若干倍）等優(yōu)勢(shì)［9-10］。AdMax系統(tǒng)只需要2~4周就能完成從質(zhì)粒構(gòu)建到重組出毒，AdMax系統(tǒng)因在真核細(xì)胞內(nèi)重組出毒，出毒成功率大于98％（其中95％的克隆含有目的基因），而AdEasy系統(tǒng)的出毒成功率只有18％~34％［11］。我們將重組的含有目的基因hIL-24片段的穿梭質(zhì)粒載體pDC316-hIL-24和骨架質(zhì)粒pBHGloxΔE1，3Cre，共同轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，包裝產(chǎn)生重組腺病毒pDC316-hIL-24，病毒活性單位為2.5× 1010U/ml，而常用的AdEasy包裝系統(tǒng)產(chǎn)生的病毒活性單位通常只有107~108U/ml，AdMax系統(tǒng)包裝的病毒活性顯然高于AdEasy包裝系統(tǒng)。本研究構(gòu)建的腺病毒pDC316-hIL-24為進(jìn)一步開展hIL-24基因功能的深入研究和重組腺病毒轉(zhuǎn)基因治療打下基礎(chǔ)。

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Construct ion of recombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 and the detection of viral titer

LI Shuhua,CHEN Tingting,LIU Yukun,LI Hao,CHENG Yiying,ZHANG Yajie Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,China

ObjectiveTo onstruct recombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 and detect the viral titer.MethodsTotal mRNA was ex tracted from HEK293 cells,and specific primer pairs were designed in order to clone human interleukin-24(hIL-24)gene cDNA by RT-PCR method.hIL-24 gene was directional constructed into shuttle plasmidr(pDC316-EGFP)after digestion by restrictive endoenzymeBglII,andHindIII.HEK293 cells were co-transfected with the constructed recombinant shuttle plasmid pDC316-EGFP and large adenovirus helper plasmid pBHGlox(delta)E1，3Cre in mediation of liposome。The constructed recombinant adenovirus vector was named pDC316-hIL-24.Recombinant adenovirus was amplificated and purificated in HEK293 ce lls.ResultsRecombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 was constructed successfully and high titer recombinant adenovirus was obtained.ConclusionThe construction of recombinant adenovirus vector pDC316-hIL-24 and the obtain of recombinant adenovirus will lay down the basis for developing gene therapy of cancer.

hIL-24;recombinant adenovirus vector;viral titer;pDC316-hIL-24

2014-04-19

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目（A2013244）；教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目博導(dǎo)類課題（20134423110001）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（S2012010010181）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014Y2-00171）；廣州市教育系統(tǒng)創(chuàng)新學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（13C06）

李書華，博士，講師，主要從事腫瘤生物治療研究

張雅潔，博士，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:yajie.zhang@163.com