張 韞，高蘇亞

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

孔雀石綠(Malachite green)又名孔雀綠、苯胺綠和鹽基塊綠，分子式為C23H25ClN2，是一種三苯甲烷類染料(Tryphenyl Methane Dyestuffs)。因其既可防治魚類的水霉病、爛鰓病、小瓜蟲病等寄生蟲病，又可用于水產(chǎn)品保鮮，所以曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用[1]。

孔雀石綠的官能團(tuán)為三苯甲烷，具有致癌、致畸和致突變等副作用[2]，對人類的生命健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。農(nóng)業(yè)部頒布的中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)無公害食品漁用藥物使用準(zhǔn)則(NY5071—2001)中明確提出孔雀石綠為禁用藥物[3]。美國等國家也在Council Directive 96/23/EC中指出孔雀石綠為B類禁用藥物不得檢出。由于孔雀石綠價格低廉，一些不法漁民仍在使用，由此引起的水產(chǎn)品殘留和相關(guān)環(huán)境污染問題不容忽視。

目前孔雀石綠常用的檢測手段有高效液相色譜法[4]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、分光光度法[6]、共振瑞利散射法[7]、酶聯(lián)免疫分析法[8]和化學(xué)發(fā)光法[9]等。流動注射與化學(xué)發(fā)光聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、線性范圍寬和分析速度快等優(yōu)點，在化學(xué)、生命科學(xué)及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。魯米諾是目前應(yīng)用最廣的化學(xué)發(fā)光劑，據(jù)報道牛血清白蛋白對魯米諾化學(xué)發(fā)光具有增敏作用，并依此構(gòu)建了魯米諾-牛血清白蛋白化學(xué)發(fā)光體系[10]。作者以孔雀石綠對魯米諾-牛血清白蛋白體系發(fā)光信號的抑制作用為基礎(chǔ)，建立了流動注射-化學(xué)發(fā)光測定納克級孔雀石綠的新方法，并成功用于魚塘水樣和海鮮儲存水樣中孔雀石綠的分析測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

IFFM-E型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀：西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司。實驗所用試劑均為市售分析純，實驗所用超純水為二次去離子水，經(jīng)過艾柯KLZ-UV系列超純水機(jī)(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)純化(電阻率18.3 MΩ)。強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂001×7(732)和強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂201×7(717)購自西安浩宇化工原料公司。魯米諾(純度≥97%)、牛血清白蛋白(分子量～66.43 kDa)、孔雀石綠(純度≥96%)：均購自Sigma-Aldrich公司，c(魯米諾儲備液)=2.5×10-2mol/L，c(牛血清白蛋白儲備液)=5.0×10-5mol/L，ρ(孔雀石綠儲備液)=1.0×10-3g/mL，以上儲備液均于4 ℃保存。

1.2 實驗方法

流動注射-化學(xué)發(fā)光法測定孔雀石綠的實驗裝置示意圖見圖1。實驗裝置由4條管路組成：魯米諾(NaOH)、牛血清白蛋白、載液(超純水)和孔雀石綠樣品溶液；蠕動泵流速為2.0 mL/min。基線穩(wěn)定后由六通閥注入的100 μL魯米諾與牛血清白蛋白和孔雀石綠樣品液的混合液再混合，并在堿性條件下流入流通池，所產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號由光電倍增管(HV：750V)檢測再經(jīng)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)記錄處理。

圖1 流動注射-化學(xué)發(fā)光法測定孔雀石綠的實驗裝置示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件優(yōu)化

實驗考察了魯米諾溶液濃度在5.0×10-7～5.0×10-4mol/L對體系發(fā)光信號的影響。當(dāng)濃度為2.5×10-5mol/L時化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)而穩(wěn)定，故以此濃度作為魯米諾的實驗濃度。

魯米諾在堿性條件下發(fā)光量子效率較高。因此在魯米諾中加入NaOH提高發(fā)光反應(yīng)的靈敏度。魯米諾濃度為2.5×10-5mol/L時，對NaOH濃度在1.0×10-3～1.0×10-1mol/L進(jìn)行了實驗。結(jié)果表明NaOH濃度為2.5×10-2mol/L時魯米諾化學(xué)發(fā)光體系的信號達(dá)到最大值，故選擇NaOH的實驗濃度為2.5×10-2mol/L。

研究表明牛血清白蛋白可以增敏魯米諾體系化學(xué)發(fā)光反應(yīng)[10]。本實驗考察了牛血清白蛋白在1.0×10-9～1.0×10-7mol/L對體系的影響。隨著牛血清白蛋白濃度增大，發(fā)光信號增強(qiáng)，當(dāng)濃度為5.0×10-9mol/L時發(fā)光信號逐漸趨于穩(wěn)定。故選擇牛血清白蛋白的實驗濃度為5.0×10-9mol/L。

實驗對混合管長度和溶液流速分別在9～19 cm和0.5～5 mL/min范圍內(nèi)進(jìn)行了優(yōu)化。綜合溶液混合效果及發(fā)光強(qiáng)度等因素，選定2.0 mL/min流速和10.0 cm混合管長度作為最佳實驗條件。

2.2 反應(yīng)體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度-時間關(guān)系

在流動注射系統(tǒng)中對魯米諾-牛血清白蛋白-孔雀石綠的發(fā)光行為進(jìn)行了考察，見圖2。牛血清白蛋白、魯米諾和NaOH濃度分別為5.0×10-9、2.5×10-5和2.5×10-2mol/L。魯米諾體系在4.4 s(tmax)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大值(Imax)130，且發(fā)光信號在15 s內(nèi)消失(曲線1)；當(dāng)流動注射系統(tǒng)中加入牛血清白蛋白時，魯米諾的Imax從130增加至405，相應(yīng)tmax從4.4 s縮短至4.0 s(曲線3)；當(dāng)10 ng/mL 孔雀石綠存在時Imax從405降低至252，而tmax不變(曲線2)。

t/s圖2 不同化學(xué)發(fā)光體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度-時間曲線

2.3 化學(xué)發(fā)光體系的穩(wěn)定性考察

考察了不同濃度孔雀石綠存在下魯米諾-牛血清白蛋白化學(xué)發(fā)光體系的穩(wěn)定性。將100 μL魯米諾注入流動注射分析系統(tǒng)，記錄化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度測試不同體系的穩(wěn)定性。實驗持續(xù)3 d，系統(tǒng)每天運(yùn)行8 h，結(jié)果列于表1。每個結(jié)果為7次進(jìn)樣測定平均值，RSD均小于2.5%，可見各發(fā)光體系穩(wěn)定性良好。

表1 流動注射-化學(xué)發(fā)光體系的穩(wěn)定性測試

2.4 測定的線性范圍和檢出限

實驗發(fā)現(xiàn)孔雀石綠能顯著猝滅魯米諾-牛血清白蛋白體系的發(fā)光反應(yīng)，且發(fā)光信號的降低值和孔雀石綠濃度對數(shù)值在0.03～1 000 ng/mL存在良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔI=27.9Lnρ + 135.4(ρ：ng/mL)，相關(guān)系數(shù)R=0.996 1，檢出限為0.01 ng/mL(3σ)。在流速2.0 mL/min條件下，完成一次測定(包括進(jìn)樣和沖洗管路)僅需30 s，采樣頻率可達(dá)120次/h。

2.5 干擾實驗

2.6 樣品分析

用于魚塘水和海鮮存儲水樣中孔雀石綠的測定。取西安市周邊魚塘水樣和市場海鮮存儲水樣各100 mL，用0.45 μm濾膜過濾，所得濾液經(jīng)強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂和強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂處理。在處理過的水樣中加入適量孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液制成模擬樣品。待混合均勻后，將模擬樣品稀釋到線性范圍，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定孔雀石綠的含量。結(jié)果分別列于表2和表3，每個數(shù)據(jù)為7次測定結(jié)果的平均值，回收率為97.1%～103.8%，RSD小于4.0%(n=7)。

表2 魚塘水樣中孔雀石綠的測定

表3 海鮮儲存水樣中孔雀石綠的測定

續(xù)表

3 結(jié) 論

以孔雀石綠對魯米諾-牛血清白蛋白體系化學(xué)發(fā)光體系的抑制作用為基礎(chǔ)，建立了超靈敏測定孔雀石綠的流動注射-化學(xué)發(fā)光分析法。具有分析速度快、靈敏度高、試劑消耗少和儀器裝置簡單等優(yōu)點，適用于環(huán)境水樣中孔雀石綠的分析測定。

[ 參 考 文 獻(xiàn) ]

[1] Cheng D M,Li B X.Simple and sensitive fluorometric sensing of malachite green with native double-stranded calf thymus DNA as sensing material[J].Talanta,2009,78(3)：949-953.

[2] Hernando M D,Mezcua M.Liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry for simultaneous determination of chemotherapeutant residuals in salmon[J].Analytica Chimica Acta,2006,562(2)：176-184.

[3] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY5070—2001無公害食品標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中漁藥殘留限量[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001：1-4.

[4] Xie J,Peng T,Chen D D,et al.Determination of malachite green,crystal violet and their leuco-metabolites in fish by HPLC-VIS detection after immunoaffinity column clean-up[J].Journal of Chromatography B,2013,913/914：123-128.

[5] López-Gutiérrez N，Romero-González R,Plaza-Bolanos P.Simultaneous and fast determination of malachite green,leucomalachite green,crystal violet,and brilliant Green in seafood by ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Food Analytical Methods,2013,6(2)：406-414.

[6] Pourreza N，Elhami S.Spectrophtometric determination of malachite green in fish farming water samples after cloud point extraction using nonionic surfactant triton X-100[J].Analytica Chimica Acta,2007,596(1)：62-65.

[7] 喻麗紅，劉忠芳，胡小莉，等.共振瑞利散射法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠[J].西南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2009,31(3)：54-57.

[8] Xu H Y,Chen X L,Guo L,et al.Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection of total malachite green and crystal violet residues in fishery products[J].International Journal of Environmental Analytical Chemistry,2013,93(9)：959-969.

[9] 張景景，楊迎春，葉芝祥，等.鐵氰化鉀-鈣黃綠素體系流動注射化學(xué)發(fā)光法測定孔雀石綠[J].分析試驗室,2012,31(5)：72-75.

[10] Wang Z M,Song Z H,Chen D H.Study on the binding behavior of bovine serum albumin with cephalosporin analogues by chemiluminescence method[J].Talanta,2010,83(2)：312-319.