楊巧紅趙自明李琳琳杜標(biāo)炎譚宇蕙周 聯(lián)

連至誠1郭玉榮4蘇俊芳1張書征1張根水5劉艷玲6

黃芪注射液促進(jìn)免疫功能低下小鼠T細(xì)胞增殖研究※

楊巧紅1趙自明2李琳琳3杜標(biāo)炎1譚宇蕙1周 聯(lián)1

連至誠1郭玉榮4蘇俊芳1張書征1張根水5劉艷玲6

目的觀察黃芪注射液對地塞米松（Dex）所致免疫功能低下小鼠T細(xì)胞增殖的影響。方法連續(xù)腹腔注射給藥5天，末次給藥后2h稱小鼠體重。結(jié)果與對照組相比，模型組小鼠胸腺指數(shù)、血清與胸腺IL-2的含量均有顯著減少（P＜0.05），而胸腺PCNA表達(dá)面積累積百分比無顯著差異（P＞0.05）。結(jié)論黃芪注射液可抑制Dex所致免疫功能低下模型小鼠的胸腺萎縮，促進(jìn)免疫功能的恢復(fù)。

免疫功能低下；黃芪注射液；地塞米松

黃芪是益氣養(yǎng)血的扶正藥物。黃芪注射液含有活性較強(qiáng)的黃芪皂苷、黃酮類、多糖類、氨基酸和微量元素，能抗菌、抗病毒、提高機(jī)體免疫功能[1-2]。研究表明，黃芪注射液可拮抗結(jié)腸癌5-氟尿嘧啶化療后小鼠CD3、CD4百分率和CD4/CD8比例的降低，促進(jìn)Th細(xì)胞增殖與分泌細(xì)胞因子，從而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化、調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群分布，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。本文擬通過復(fù)制地塞米松所致免疫功能低下小鼠模型觀察黃芪注射液對T細(xì)胞增殖促進(jìn)效應(yīng)及其與PCNA表達(dá)相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級KM小鼠72只，雌雄各半，5周齡，體重20g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 藥品與試劑 地塞米松磷酸鈉注射液（廣州白云山天心制藥股份有限公司，1ml/支，5mg/ml，批號H44022091，產(chǎn)品批號：071002）；黃芪注射液（成都地奧九泓制藥廠，10ml×16支/盒，批號Z51021776）。

1.1.3 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Sanyo公司），96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Hyclone公司）；MK3型酶聯(lián)檢測儀（荷蘭THERMO）；IX2-ILL100倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯產(chǎn)品）；高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；微孔慮菌器（美國Millopore公司）；電子天平、電泳儀、多媒體圖像分析儀（Image-pro PLUS5.1,Media Cybernetics公司）；5ml玻璃勻漿器等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 72只KM小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、IL-2組（5IU?kg-1）、黃芪注射液高劑量（HQH,2g?kg-1），黃芪注射液中劑量（HQM,1g?kg-1），黃芪注射液低劑量（HQL,0.5g?kg-1）共 6組，每組12只。除正常對照組外，其余各組小鼠每日腹腔注射Dex（25mg?kg-1），共2天。給藥方式：對照組、模型組動物腹腔注射生理鹽水各0.2ml?d-1；黃芪注射液高、中、低劑量組分別腹腔注射黃芪注射液2g?kg-1、1g?kg-1、0.5g?kg-1；IL-2組以5IU?kg-1腹腔注射IL-2，共5天。

1.2.2 各組小鼠胸腺指數(shù)比較 末次給藥后2h稱體重，對小鼠行使安樂死，取胸腺稱重，計(jì)算胸腺指數(shù)。

1.2.3 各組小鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對小鼠行使安樂死，取胸腺入10%甲醛溶液內(nèi)固定過夜，包埋、石蠟切片、蘇木素-伊紅染色處理，做組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.4 ELISA比較各組小鼠胸腺勻漿及血清IL-2含量 實(shí)驗(yàn)5天后對已行安樂死的小鼠摘取眼球取血液，制備小鼠含藥血清，并分離胸腺，制備胸腺勻漿上清液，ELISA法檢測IL-2含量參照武漢博士德生物有限公司提供的Mouse IL-2 ELISA kit說明書進(jìn)行檢測。

1.2.5 小鼠胸腺PCNA表達(dá)比較

1.2.5.1 Western免疫印跡法比較各組小鼠胸腺PCNA表達(dá) 取一半胸腺組織，加0℃ 0.5ml蛋白裂解液勻漿2min，4℃ 12000rpm離心10min，吸取上清液，采用Western免疫印跡觀察胸腺PCNA表達(dá)。

1.2.5.2 免疫組織化學(xué)染色方法檢測PCNA表達(dá) 參照Caspase-3免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。用Image-pro plus多媒體圖像分析儀，以5個(gè)視野平均值作為該樣本的測量值。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法上述統(tǒng)計(jì)均由SPSS 15.0完成。所有計(jì)量資料以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胸腺形態(tài)學(xué)的改變黃芪注射液用藥5天后，各組小鼠胸腺病理形態(tài)學(xué)變化如下圖：①對照組：胸腺皮髓質(zhì)界限較為清晰，皮質(zhì)較厚，胸腺細(xì)胞密集，皮髓質(zhì)比例約為1.5～2.0；②模型組：皮質(zhì)變薄，皮質(zhì)髓質(zhì)細(xì)胞明顯減少，皮髓質(zhì)界限不清晰，網(wǎng)狀上皮細(xì)胞清晰可見；③IL-2組：皮髓質(zhì)變薄程度和皮質(zhì)胸腺細(xì)胸減少程度較模型組輕，網(wǎng)狀上皮細(xì)胞清晰可見；④HQH：皮髓質(zhì)較模型組明顯增厚，皮質(zhì)胸腺細(xì)胞比模型組明顯增多，皮髓質(zhì)界限明顯清晰；⑤HQM：皮髓質(zhì)變薄程度和皮質(zhì)胸腺細(xì)胸減少程度較模型組輕；網(wǎng)狀上皮細(xì)胞清晰可見；⑥HQL：皮髓質(zhì)較模型組明顯增厚，皮質(zhì)胸腺細(xì)胞比模型組明顯增多，皮髓質(zhì)界限明顯清晰，網(wǎng)狀上皮細(xì)胞顯得稀疏。

圖1

2.2 黃芪注射液對小鼠胸腺指數(shù)的影響見表1。

表1 黃芪注射液治療5天后各組小鼠胸腺指數(shù)的變化(±s)

表1 黃芪注射液治療5天后各組小鼠胸腺指數(shù)的變化(±s)

注：與模型組相比，**P＜0.01；與IL-2相比，##P＜0.01；與HQL比較，△△P＜0.01；與HQM比較，▲▲P＜0.01

組別 n 胸腺指數(shù)(mg/g)對照組65.66±0.38**模型組6 1.32±0.26 IL-2組6 1.70±0.57 HQL 6 1.42±0.31**##HQM 6 1.40±0.33**##△△HQH 6 2.04±0.43**##△△▲▲

2.3 黃芪注射液對各組小鼠血清、胸腺中 IL-2的含量比較見表2。

表2 黃芪注射液治療5天后各組小鼠血清、胸腺中IL-2含量比較(±s)

表2 黃芪注射液治療5天后各組小鼠血清、胸腺中IL-2含量比較(±s)

注：與模型組相比，**P＜0.01；與IL-2相比，##P＜0.01；與HQL比較，△△P＜0.01；與HQM比較，▲▲P＜0.01

組別 n 血清 胸腺對照組621.72±4.48*135.75 ±11.15**模型組6 18.24±3.35 82.93±11.56 IL-2組6611.32±5.35**451.47±14.61 HQL 647.27±5.01**##211.84±12.28**##HQM 620.93±2.61**##△△170.32±16.62**##△△HQH 620.12±4.04##△△192.24±12.13**##△△▲▲

2.4 黃芪注射液對光鏡下各組小鼠胸腺 PCNA表達(dá)比較小鼠胸腺淋巴細(xì)胞核抗原PCNA陽性細(xì)胞細(xì)胞核呈棕黃色。與模型組比較，對照組小鼠胸腺PCNA表達(dá)面積百分率無明顯差異（P＞0.05），IL-2組、HQL、HQM、HQH組小鼠胸腺PCNA表達(dá)面積百分率有明顯差異（P＜0.01），與IL-2組比較，HQL組小鼠胸腺PCNA表達(dá)面積百分率有明顯差異（P＜0.01），而HQM、HQH組小鼠胸腺胸腺PCNA表達(dá)面積百分率無明顯差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠胸腺PCNA陽性細(xì)胞面積百分比[(±s),%]

表3 各組小鼠胸腺PCNA陽性細(xì)胞面積百分比[(±s),%]

組別 n PCNA陽性細(xì)胞面積百分比對照組 6 5.22±3.85模型組 6 7.86±3.38 IL-2組 6 14.55±6.79**HQL 6 27.88±7.08**##HQM 6 15.96±7.10**△△HQH 6 16.21±4.51**△△

3 討論

胸腺作為重要的免疫器官，是T淋巴細(xì)胞發(fā)生的場所。在生理?xiàng)l件下未成熟T細(xì)胞在胸腺皮質(zhì)部接受細(xì)胞因子刺激信號表達(dá) PCNA等細(xì)胞增殖因素，從而促進(jìn)T細(xì)胞增殖，90%成熟TCRα、βT細(xì)胞來源于胸腺[3]。研究表明，感染性病變，尤其是急性感染性病變可能會導(dǎo)致胸腺萎縮，從而導(dǎo)致免疫功能降低。因此，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠腹腔注射地塞米松構(gòu)建免疫功能低下動物模型，結(jié)果表明，Dex腹腔注射后可導(dǎo)致小鼠胸膛萎縮、血清與胸腺IL-2含量降低等免疫功能低下性表現(xiàn)，提示模型復(fù)制成功。

黃芪多糖（APS）提取自中草藥黃芪，具有強(qiáng)大的提高機(jī)體免疫功能作用，APS能誘導(dǎo) CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-2和IFN-γ，并且能提高CD8+T細(xì)胞中IFN-γ表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中用黃芪多糖治療免疫功能低下小鼠5天后，從形態(tài)學(xué)、胸腺指數(shù)、IL-2含量及PCNA表達(dá)作為研究的指標(biāo)。IL-2是免疫調(diào)節(jié)核心物質(zhì)，主要活化CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生，是所有T細(xì)胞亞群的生長因子，與T細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程密切相關(guān)，可促進(jìn)B細(xì)胞分化與增殖、增強(qiáng)殺傷T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的免疫活性[4]。本研究結(jié)果表明，模型組小鼠血清及胸腺勻漿液中IL-2水平均較正常對照組降低，而 IL-2組和黃芪三劑量組均能不同程度增加免疫功能低下小鼠血清及胸腺 IL-2水平，提示外源性IL-2和黃芪注射液可通過增加IL-2水平，促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞增殖，拮抗Dex所致胸腺萎縮。

PCNA又稱周期素，本研究表明，IL-2組與黃芪注射液三劑量組均可不同程度促進(jìn)小鼠胸腺PCNA表達(dá)，提示IL-2與黃芪注射液均可促進(jìn)體內(nèi)胸腺淋巴細(xì)胞增殖。為了探討黃芪注射液的治療作用是否通過促進(jìn)胸腺淋巴細(xì)胞的增殖而達(dá)到，本研究采用免疫組化和 Western-blot實(shí)驗(yàn)觀察了各黃芪治療組胸腺細(xì)胞PCNA的表達(dá)情況。結(jié)果表明，各劑量黃芪注射液均提高了模型小鼠胸腺組織中PCNA陽性細(xì)胞的比例；Western-blot結(jié)果也驗(yàn)證了該結(jié)論。上述結(jié)果提示，黃芪中的有效成分具有顯著促進(jìn)體內(nèi)胸腺淋巴細(xì)胞增殖的作用。

[1] 劉莎,符州.黃芪的免疫調(diào)節(jié)作用及其臨床應(yīng)用[J].國際中醫(yī)中藥雜志,2006,28(4):203-206.

[2] 殷平善.黃芪的臨床應(yīng)用及其藥理中的整體系統(tǒng)思維[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2006,17(7):1313-1315.

[3] Manley NR,Richie ER,Blackburn CC,et al.Structure and function of the thymic microenvironment[J].Frontiers in bioscience:a journal and virtual library,2011,1(16):2461-2477.

[4] 龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京:科技出版社,2000.

Astragalus Injection on Proliferation of T cell immune Function of Immunosuppressed mice Yang Qiaohong Zhao Ziming Li Linlin Du Biaoyan Tan Yuhui Zhou Lian Lian Zhicheng

Guo Yurong Su Junfang Zhang Shuzheng Zhang Genshui Liu Yanling

ObjectiveTo observe the effect of astragalus injection of dexamethasone(Dex) proliferation induced immunosuppressed mice T cells.MethodsBesides control group,the other five groups were injected Dex 5 days for immunodeficient mice model,two hours after the final injection,weight recorded.ResultsCompared with the control group, thymus index and IL-2 of serum and thymus homogenate in model group were significantly reduced(P＜0.05),but protein expression of PCNA had no significant difference(P＞0.05).ConclusionImmunity was impaired in mice exposed to Dex,AI could play an important role in recovering the immune function,the mechanisms would be further researched.

Immunodeficient mice;Astragalus injection;Dexamethasone

R285.5

A

1673-5846(2014)01-0036-03

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405

2廣東省中醫(yī)研究所，廣東廣州 510405

3南方醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣東廣州 510515

4廣西柳州市中醫(yī)院，廣西柳州 545001

5廣州醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405

6北大第三醫(yī)院婦科生殖醫(yī)學(xué)中心，北京 100083

廣東省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目資助（2007058）

劉艷玲，Email：Liuyanling1958@163.com。