王莉君 劉 宏

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830000；2.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000)

豬口蹄疫O型緬甸98系毒株對(duì)乳鼠的適應(yīng)性研究

王莉君1劉 宏2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830000；2.新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000)

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒引起的豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物的一種烈性傳染病，給流行國(guó)家和地區(qū)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，篩選與田間流行毒株基因型相近的、免疫原性良好的、適合生產(chǎn)特性的制造疫苗毒株，將對(duì)疫情的有效控制會(huì)起到非常重要的作用。

本論文針對(duì)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的四株?yáng)|南亞拓?fù)湫途挼?8系O型口蹄疫乳鼠毒，在乳鼠上進(jìn)行傳代，對(duì)各毒株的收毒時(shí)間和最終代次的毒價(jià)進(jìn)行比較，并根據(jù)結(jié)果選擇對(duì)乳鼠適應(yīng)性最好的一株，作為檢驗(yàn)用毒株，并為生產(chǎn)用毒株的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

四株?yáng)|南亞拓?fù)湫途挼?8系O型口蹄疫乳鼠毒，分別為O/ GD/10-8株、O/GD/10-9株、O/GX/10-10株、O/XJ/10-11株；2～3日齡昆明系乳鼠帶母鼠飼養(yǎng)；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）；50%甘油-磷酸鹽緩沖液；石英砂購(gòu)自天津盛奧精細(xì)化工公司；高速低溫離心機(jī)；冷藏冷凍兩用冰箱；眼科手術(shù)剪、鑷；注射器；移液器；陶瓷研缽。

1.2 方法

1.2.1 磨毒傳代

分別將四支O型口蹄疫乳鼠毒稱重，取約1g加入滅菌后的研缽，再加入適量滅菌石英砂充分研磨，期間加入適量PBS，使之完全研磨成勻漿，最終制成1：10的組織懸液，放在2～8℃的冰箱中，浸毒16～20h。浸毒結(jié)束后，使用低溫離心機(jī)，在4℃左右以3000r/min離心20mn，吸取上清液，于頸背部皮下接種2～3日齡的乳鼠8～12只，每只乳鼠的注射量為0.1ml。接種后觀察，并收取發(fā)病典型的瀕死乳鼠或死亡乳鼠，將乳鼠用1：50新潔爾滅清洗兩遍，再用PBS清洗兩遍后，剪去頭、四肢、尾，剪開(kāi)胸腔和腹腔，剔除內(nèi)臟，剝?nèi)テず推は轮?，?0%甘油-磷酸鹽緩沖液保存。此胴體即為第一代乳鼠毒（MF1）。按上述方法，繼續(xù)稱重、研磨，即可進(jìn)行下一代乳鼠毒的傳代工作。

1.2.2 LD50測(cè)定

將所取毒樣混合均勻，抽取毒樣0.2ml，沿管壁緩慢注入盛有1.8ml稀釋液的離心管中。加樣時(shí)吸頭尖不得接觸稀釋液液面，并重復(fù)吹兩次，盡量減少吸頭內(nèi)壁殘留液體，然后將管內(nèi)液體混勻，更換吸頭準(zhǔn)備進(jìn)行下一步稀釋。以此方法作10倍系列稀釋，期間每個(gè)滴度換一支吸頭，取10-5，10-6，10-7，10-8等各稀釋度，每稀釋度頸背部皮下接種2～3日齡的乳鼠4～5只，每只注射0.2ml，各稀釋度分別作標(biāo)記。將乳鼠置于23～26℃室溫環(huán)境下，帶母鼠飼養(yǎng)。每日觀察1～2次，記錄每次觀察時(shí)發(fā)病、死亡的乳鼠只數(shù)。于注射后24h之前死亡乳鼠不計(jì)數(shù)。連續(xù)觀察4～7日，根據(jù)發(fā)病死亡乳鼠數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算LD50。

2 結(jié)果與分析

在乳鼠傳代過(guò)程中，四株毒的收毒時(shí)間和最終代次的LD50如下表所示：

由上表可知，毒價(jià)方面，四株毒種在傳至MF5代時(shí)，O/ GD/10-8株最高，O/GD/10-9株、O/XJ/10-11株次之，O/GX/10-10株相對(duì)略低。病毒收毒時(shí)間方面，O/GD/10-8株在MF3和MF4兩代中，發(fā)病、死亡時(shí)間出現(xiàn)反復(fù)，而且波動(dòng)較大，在MF5代收毒時(shí)，發(fā)病后死亡時(shí)間拖延至9.5h（12.5h～22h收）；O/GD/10-9株同O/GD/10-8株相似，在MF3和MF4兩代中，發(fā)病、死亡時(shí)間出現(xiàn)反復(fù)，在MF5代收毒時(shí)，發(fā)病后死亡時(shí)間略有延長(zhǎng)，拖延至7.5h（17h～24.5h收）；O/GX/10-10株也是在MF3和MF4兩代中，發(fā)病、死亡時(shí)間出現(xiàn)反復(fù)，但在MF5代收毒時(shí)，發(fā)病后死亡時(shí)間為4.5h（15h～19.5h收）；O/XJ/10-11株從MF1代至MF5代，發(fā)病、死亡時(shí)間一直呈逐步縮短的狀態(tài)，在MF5代收毒時(shí)，發(fā)病后死亡時(shí)間為2h（17.5h～19.5h收）。

綜合毒價(jià)高低和收毒時(shí)間長(zhǎng)短，在對(duì)乳鼠的適應(yīng)性方面，選擇了收毒時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定、毒價(jià)比較高的O/XJ/10-11株繼續(xù)進(jìn)行了傳代，傳至MF7代時(shí)，收毒時(shí)間趨于穩(wěn)定（15h～18h），測(cè)得LD50為10-8.0/0.2ml。

3 討論與結(jié)論

四株口蹄疫毒種在傳代過(guò)程中，能較快的適應(yīng)乳鼠，并且乳鼠的發(fā)病、死亡時(shí)間基本呈現(xiàn)逐漸縮短、集中的趨勢(shì)，但在細(xì)節(jié)上略有區(qū)別。毒價(jià)方面，四株毒種MF5代的毒價(jià)差異不大，LD50均不低于10-7.5/0.2ml。綜合毒價(jià)和收毒時(shí)間兩方面因素考慮，在對(duì)乳鼠的適應(yīng)性方面，選擇了收毒時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定、毒價(jià)比較高的O/XJ/10-11株繼續(xù)進(jìn)行傳代，傳至MF7代，收毒時(shí)間趨于穩(wěn)定（15h～18h），MF7代測(cè)得LD50為10-8.0/0.2ml。本研究結(jié)果顯示，四株待選毒株中，O/XJ/10-11株對(duì)乳鼠的適應(yīng)性最好，致病性強(qiáng)，傳代過(guò)程穩(wěn)定，收毒時(shí)間短，可作檢驗(yàn)用毒株使用。

表2 -1 四株口蹄疫種毒鼠毒收毒時(shí)間和最終代次的LD50