李 雁 王建明

(太原動物園,山西太原 030009)

太原地區(qū)羅非魚紅細胞免疫功能研究

李 雁 王建明

(太原動物園,山西太原 030009)

目的：為探討非靈長類動物體內是否存在紅細胞免疫功能及是否存在免疫黏附受體分子。方法：實驗以經濟魚類為研究對象并設計試驗,運用熒光顯微鏡及免疫電鏡技術,從細胞學水平上觀察了羅非魚紅細胞對血清致敏的綠色熒光大腸桿菌(GFP-E.coli)的免疫黏附現(xiàn)象；運用掃描免疫電鏡對羅非魚免疫粘附現(xiàn)象進行觀察,并通過細胞花環(huán)試驗對太原地區(qū)代表性養(yǎng)殖魚塘中的羅非魚進行了紅細胞免疫功能的測定；選用本實驗自制提取的黃芪雜多糖拌料投喂羅非魚,觀測黃芪雜多糖的免疫增強作用。結論：羅非魚紅細胞具有免疫粘附功能且以高劑量700mg/kg飼料的劑量拌料投喂,可增強羅非魚紅細胞免疫功能。

魚紅細胞；免疫粘附；黃芪雜多糖

目前，人類醫(yī)學領域中已成形成完整的紅細胞免疫系統(tǒng)概念，大量的研究證實其在體內廣泛地參與特異性與非特異性免疫、機體免疫調控，而紅細胞CR1是紅細胞免疫功能最重要的物質基礎。然而，縱觀動物紅細胞免疫研究進展，對于非靈長類動物體內是否存在紅細胞免疫黏附現(xiàn)象以及免疫黏附現(xiàn)象是否由CR1與活化的補體成分之間的反應來介導等方面的問題仍然存在爭議。因此，本實驗設計以主要經濟魚類羅非魚為研究對象，運用顯微技術及免疫學相關方法來探討魚類紅細胞免疫黏附功能及其分子基礎，以期能為動物紅細胞免疫研究提供參考。

1 試驗材料

1.1 試驗動物

尼羅羅非魚（太原市金勝村），紅尾羅非魚（太原市吳家堡村），熒光大廠桿菌（GFP-E.coli）為實驗室凍存，釀酒酵母（Saccharomyces cereviseae）為本實驗室保存菌。

1.2 主要試劑、儀器

黃芪雜多糖：本實驗室粗提粉。

雷公藤多甙片（10mg/片）：上海復旦復華藥業(yè)有限公司，批號：100308。

EDTA抗凝管（湖南三力醫(yī)藥器械廠），淋巴細胞分離液（中國醫(yī)學科學院生物工程研究所研制），戊二醛（成都科龍化工試劑廠，分析純），PBS（0.1mol/L，pH=7.4），PBSB（10mM的葡萄糖和0.1%的BSA），0.9%NaCl，新鮮兔血清，LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基，氨芐青霉素（100μg/mL），LB液體培養(yǎng)基（含100μg/mL氨芐青霉素），LB固體培養(yǎng)基（含100μg/mL氨芐青霉素）；梯度酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），鋨酸（北京恒業(yè)中遠化工廠），環(huán)氧樹脂Epon812（北京恒業(yè)中遠化工廠）；酸度計（HANNA，pH211），熒光顯微鏡（BX51TF，Japan），掃描電鏡（JSM-6400，Japan），濺射噴金儀（JFC-1600，Japan）

2 試驗步驟

2.1 羅非魚血清制備

選取健康、個體均勻羅非魚個體，尾靜脈采血，EDTA抗凝，按照血液：淋巴細胞分離液=1：2的比例將血液緩慢加入分離液表面，分離血清，血清標明品種保存?zhèn)溆茫?/p>

2.2 羅非魚紅細胞懸液制備

取上述紅細胞沉淀，用生理鹽水洗滌、離心2次（2 000 r/ min，5 min），配制成濃度為1.5×107／mL的紅細胞懸液。

2.3 熒光大腸桿菌制備

（1）GFP-E.coli復蘇與純化

取試管加入5mL的LB液體培養(yǎng)基，將凍存GFP-E.coli接種于培養(yǎng)基中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)13h，再轉入含100μg/ml氨芐青霉素鈉的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。挑取培養(yǎng)的菌懸液在含100μg/ml氨芐青霉素鈉的LB固體培養(yǎng)基上接種，37℃培養(yǎng)箱中過夜，取單菌落接種于含100μg/ml氨芐青霉素鈉的LB液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)過夜。利用倍比稀釋方法制備梯度菌液，分別涂板，選長出菌落范圍在20～200板計算菌濃度。

公式一：

每管細菌濃度（個/ml）=（三個重復板菌落數(shù)的和/3）×稀釋倍數(shù)×10

公式二：

細菌總濃度（個/ml）=各管細菌濃度的平均值

（2） GFP-E.coli的致敏：

取濃度為1.68×109/mL的GFP-E.coil懸液100μl，與0.9mL的新鮮羅非魚血清混勻，于37℃下孵育1h，孵育完畢，2000rmp離心5min。棄去上清，菌重懸于PBSB中，涂片鏡檢，無異常備用。

2.4 羅非魚紅細胞免疫粘附光鏡觀察

取尼羅羅非魚紅細胞懸液離心洗滌兩次，重懸后鏡檢無異常備用。分別取3支EP管，編號為A、B、C。三管中各加入500μl紅細胞懸液。A管中加入致敏GFP-E.coli懸液，B管中加入未致敏處理的GFP-E.coil菌液，C管中加入PBS，37℃，70r/min振蕩孵育1h，孵育完畢后1500r/min，5min，離心洗滌兩次，洗滌時候，特別注意動作要輕柔。PBSB重懸，涂片，熒光顯微鏡檢。

紅尾羅非魚紅細胞處理同上。

2.5 羅非魚紅細胞免疫粘附電鏡觀察

（1）分別取尼羅羅非魚、紅尾羅非魚致敏GFP-E.coli孵育組細胞懸液；

（2）1500rpm，離心5min，棄去上清；

（3）用2～3%的戊二醛固定1.5h；

（4）用磷酸緩沖液清洗3次，每次5min；

（5）用50%、70%、80%、90%乙醇梯度脫水，各梯度10min，再用100%乙醇脫水3次，每次30min；

（6）用叔丁醇置換3次，每次30min；

（7）用冷凍干燥儀干燥樣品；

（8）用雙面膠帶將樣品粘到樣品臺上；

（9）用離子濺射儀給樣品鍍10nm金膜，上鏡觀察。

2.6 羅非魚紅細胞免疫粘附花環(huán)試驗

（1）酵母的制備

將酵母多糖試劑用生理鹽水洗滌，配成1×108/ml 細胞懸液，分為兩份，一份加等量羅非魚血清混勻，37℃，30min，洗滌并恢復原濃度，另一份不做處理，備用。

（2）紅細胞受體（RBC-C3bR）花環(huán)試驗

取致敏酵母多糖懸液分別與尼羅羅非魚、紅尾羅非魚紅細胞懸液各50μL混合。37℃，水浴30 min，然后加入pH 值為7. 2的Hank’s液100μl，混勻；再加入4%的多聚甲醛25μl，固定5 min；平行涂片2張，自然干燥，甲醇固定2 min，再用Wright-Giemsa復合染色30 min；高倍鏡檢，以1個紅細胞粘附2個或2個以上酵母者為1個花環(huán)，計數(shù)200個紅細胞，求出花環(huán)率。

（3）紅細胞免疫復合物（RBC一ICR）花環(huán)試驗

取非致敏酵母懸液分別于尼羅羅非魚、紅尾羅非魚紅細胞懸液50μl混合，37℃，水浴30 min，然后加入pH 值為7. 2 的Hank’s液100μl，混勻；再加入4%的多聚甲醛25μl，固定5 min；平行涂片2張，自然干燥，甲醇固定2 min，再用Wright-Giemsa復合染色30 min；高倍鏡檢，以1個紅細胞粘附2個或2個以上酵母者為1個花環(huán)，計數(shù)200個紅細胞，求出花環(huán)率。

2.7 中藥飼料添加劑對羅非魚紅細胞免疫粘附的影響

選用本實驗室提取精制的黃芪多糖為中藥添加劑，兩品種羅非魚均按照單因素完全隨機設計，隨機分為4組，每組8尾，另取8尾作為空白對照組，第Ⅰ組為空白對照組，第II、III組為實驗組（AHPS高、低劑量處理組），拌料投喂（見表1）。

表1 試驗分組及處理

于最后一天拌料投喂結束，全群羅非魚采血，分組標記，按照2.6試驗操作，計算各組紅細胞花環(huán)率。

3 試驗結果

3.1 GFP-E.coli鏡檢結果

GFP-E.coli經過復蘇純化，在菌體內表達綠色熒光蛋白。在熒光場下，綠色熒光清晰可見。GFP-E.coli電鏡下觀察，結果顯示GFP-E.coli呈短棒狀，兩端鈍圓，長度約為2～3μm。表明，凍存GFP-E.coli復蘇成功，生長良好，且能夠被激發(fā)出綠色熒光，可以作為粘附報告因子以用于后續(xù)試驗。

3.2 羅非魚紅細胞免疫粘附光鏡觀察

GFP-E.coli經新羅非魚血清致敏，于37℃下與紅細胞孵育后，涂片鏡檢。鏡檢結果發(fā)現(xiàn)，在紅細胞表面可清晰觀察到綠色熒光，說明被新血清致敏后的GFP-E.coli，可以被紅細胞黏附，所以能夠在紅細胞表面觀察到GFP-E.coli體內表達的綠色熒光，充分說明羅非魚紅細胞可以免疫黏附經血清補體作用過的GFP-E. coli；

未經新鮮羅非魚清致敏的GFP-E.coli與紅細胞孵育之后，涂片鏡檢。結果發(fā)現(xiàn)在羅非魚紅細胞表面未能觀察到綠色熒光，只可見紅細胞洗滌之后殘留下的少數(shù)GFP-E.coli，因此在視野中也可以觀察到綠色熒光，這就表明紅細胞與未經新鮮血清致敏的GFP-E.coli并未發(fā)生免疫黏附現(xiàn)象。

圖1 如A中箭頭所指，可以看出尼羅羅非魚紅細胞與GFP-E.coli兩者發(fā)生免疫黏附（1000×）；B中箭頭所指為尼羅羅非魚紅細胞及殘留的少數(shù)GFP-E.coli菌體，兩者之間分散存在，沒有發(fā)生免疫黏附現(xiàn)象（1000×）；C中可以看出紅尾羅非魚紅細胞與GFP-E.coli兩者發(fā)生免疫黏附（1000×），D中可以看出紅尾羅非魚紅細胞及殘留少數(shù)GFP-E.coli菌體，兩者之間分散存在，沒有發(fā)生免疫黏附現(xiàn)象（1000×）。

3.3 羅非魚紅細胞免疫粘附掃描電鏡觀察

經新鮮羅非魚血清致敏后的GFP-E.coli與紅細胞孵育，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，掃描電鏡下能夠清楚地看到紅細胞表面黏附有數(shù)量不等的GFP-E.coli。由此可見，兩個品種的羅非魚紅細胞能夠黏附經血清致敏的GFP-E.coli。

圖4 作圖為掃描電鏡下尼羅羅非魚紅細胞黏附著數(shù)量不等的致敏GFP-E.coli（8000×），右圖為紅尾羅非魚紅細胞粘附現(xiàn)象

3.4 羅非魚紅細胞花環(huán)試驗

花環(huán)試驗結果表明，致敏酵母菌可與羅非魚紅細胞形成花環(huán)，未致敏酵母菌可與紅細胞形成花環(huán)，尼羅羅非魚、紅尾羅非魚紅細胞免疫粘附受體花環(huán)率依次為：31.80±1.86、30.09±1.67，IC花環(huán)率依次為24.40±1.41、23.36±2.64。

表2 羅非魚花環(huán)率結果

3.5 中藥飼料添加劑對羅非魚紅細胞免疫粘附的影響

結果顯示，尼羅羅非魚空白對照組、高劑量組、低劑量組RBC-C3bR依次為31.80±1.8、42.16±3.22、38.83±1.17，其RBC-ICR值依次為24.40±1.41、23.28±3.32、24.04±2.66；紅尾羅非魚空白對照組、高劑量組、低劑量組RBC-C3bR依次為30.09 ±1.67、40.39 ±2.51、36.23 ±1.08，其RBC-ICR值依次為23.36±2.64、22.64±2.81、23.04±1.06，（見表3，表4）。

表3 黃芪雜多糖對尼羅羅非魚花環(huán)率影響結果

表4 黃芪雜多糖對紅尾羅非魚花環(huán)率影響結果

4 分析討論

4.1 羅非魚紅細胞免疫黏附試驗結果分析

人紅細胞表面的補體受體分子可以結合補體致敏的免疫復合物、病毒、細菌等外源分子，稱之免疫黏附（immune adhere，IA）。免疫黏附是紅細胞的最重要的免疫功能，因此免疫黏附受體是紅細胞免疫深入研究的基石。Duke（1930）首次觀察到靈長類動物的紅細胞能夠結合血清致敏的錐蟲[32]。此后，R. A. Nelson研究表明紅細胞免疫黏附功能受血清中的補體成分complement 3（C3），complement 4（C4）的介導[33]，其中補體C3的作用更為明顯[88]。細菌、病毒等分子進入血液后激活補體系統(tǒng)，導致C3與酶分子內硫酯結合，發(fā)生親核反應，引起C3裂解為具有高活性的C3b片段[5]。通過C3b包被在外源分子表面完成對外源分子的致敏并形成免疫復合物（Immune complex，IC），進而人紅細胞通過其表面補體受體與C3b特異性結合將致敏分子黏附于紅細胞表面，可見介導紅細胞免疫黏附的并不是C3本身，而是其酶解產物C3b[34]。國內上世紀九十年代，陳思義，王旭東等人沿用人醫(yī)理論，探討了牛、雞、犬等不同動物的紅細胞花環(huán)率[21][25][26][28]。但是縱觀而言，動物紅細胞免疫黏附受體的研究仍然存在方法單一的問題，進而限制了動物紅細胞免疫的研究步伐。

本實驗中，用新鮮血清致敏GFP E.coli，GFP E.coli激活血清中補體成分，產生的補體活性片段包被于GFP E.coli表面，進而與紅細胞表面特異性補體受體結合，發(fā)生黏附。由于紅細胞表面黏附有GFP E.coli，因此在熒光顯微鏡下可見致敏GFP-Ecoil孵育組紅細胞表面帶有綠色熒光，結果證實豬紅細胞膜表面存在可以特異結合補體活性片段的活性分子即膜補體受體分子。未經血清致敏的GFP E.coli由于失去補體活性片段的介導而不能與紅細胞表面的補體受體分子結合，進而不能被紅細胞免疫黏附。所以，GFPEcoil未致敏孵育組紅細胞表面未能觀察到綠色熒光。由此可見，豬紅細胞膜表面存在特異性免疫黏附受體——膜補體受體分子，而且紅細胞與致敏病原粒子之間的免疫黏附屬于抗原抗體反應，即紅細胞膜補體受體分子具有特異性，這也正是前人研究中紅細胞花環(huán)的物質基礎。

本實驗采用掃描免疫電鏡進一步觀察了紅細胞與GFP E.coli的免疫黏附現(xiàn)象。掃面電鏡結果可見羅非魚紅細胞表面黏附有數(shù)量不等的致敏GFP E.coli，表明紅細胞表面存在有特異性免疫黏附受體—膜補體受體，其可以與致敏GFP E.coli表面的補體活性成分特異性地結合，進而致敏GFP E.coli被紅細胞黏附于表面，說明紅細胞與致敏GFP E.coli之間是特異性地結合，而非外力因素干擾所致。

本實驗采用基因工程菌的綠色熒光作為報告因子，不需要特殊染色或標記，可以在熒光場下直接觀察紅細胞對致敏GFP E.coli的免疫黏附作用，而且實驗中利用電子顯微鏡從微觀上觀察紅細胞黏附致敏GFP E.coli的現(xiàn)象，進而提高了紅細胞免疫黏附結果的精確性和科學性。

4.2 羅非魚紅細胞免疫粘附功能測定

本試驗結果表明，這兩品種羅非魚紅細胞上均存在免疫粘附受體，從而羅非魚紅細胞具有重要的免疫功能；進一步提示，由于種屬相近，其紅細胞上粘附受體的數(shù)量無顯著差異。正常羅非魚紅細胞粘附受體花環(huán)率高于紅細胞免疫復合物花環(huán)率，這是因為在正常情況下.體內形成的抗原一抗體一補體復合物及C3自然分解產生的C3b 均較少，因而占位的粘附受體較少.故紅細胞粘附受體花環(huán)率明顯高于紅細胞免疫復合物花環(huán)率。這與郭峰等人報道的人及動物紅細胞花環(huán)率結果相似。

4.3 中藥飼料添加劑對羅非魚紅細胞免疫粘附的影響

從結果中看出，尼羅羅非魚黃芪多糖高劑量、低劑量投喂組其紅細胞花環(huán)率相比空白組有顯著提高（P＜0.05）；紅尾羅非魚黃芪多糖高劑量、低劑量投喂組其紅細胞花環(huán)率相比空白組亦有顯著提高（P＜0.05），兩品種羅非魚均以以700mg/kg劑量拌料投喂免疫增強效果較好。但是，可能由于品種差異較小或樣本數(shù)量問題，兩品種間數(shù)據(jù)未見有顯著差異。

人及動物紅細胞C3 b 受體花環(huán)率的高低與機體健康狀況有一定關系，患惡性腫瘤、白血病、貧血、雞傳染性法氏囊病、雞馬立克氏病等疾病時，紅細胞受體花環(huán)率下降[35][36][37]。本實驗初步證實黃芪雜多糖可以增強羅非魚非特異性免疫反應，但是魚的各種疾病是否也對紅細胞粘附受體花環(huán)率有一定影響尚需進一步探討。

5 結論

（1）太原市金勝村、吳家堡村的羅非魚紅細胞具有免疫功能，可以粘附致敏復合物，尼羅羅非魚、紅尾羅非魚的紅細胞花環(huán)率依次為31.80±1.86、30.09±1.67，可作為臨床基礎數(shù)據(jù)參考；

（2）黃芪雜多糖作為飼料添加劑對尼羅河羅非魚、紅尾羅非魚均具有免疫增強作用。

（3）本實驗初步證實黃芪雜多糖可以增強羅非魚紅細胞免疫功能，但是魚的其他疾病是否也對紅細胞粘附受體花環(huán)率有一定影響尚需進一步探討。

[1] Birmingham DJ，Hebert LA.CR1 and CR1-like：the primate immune adherence receptors[J].Immunol Rev，2001，180：100-11.Review.

[2] 紅細胞免疫的物質基礎及影響因素，浙江畜牧獸醫(yī)趙孟春，李宏全，段瑞旭，白瑞，2007年第3期

[3] Rowe JA，Raza A，Diallo DA，et al.Erythrocyte CR1 expression level does not correlate with a HindIII restriction fragment length polymorphism in Africans：implications for studies on malaria susceptibility [J].Genes and Immunity，2002，3：497-500.

[4] Cockburn IA，Rowe JA.Erythrocyte complement receptor 1（CR1）expression level is not associated with polymorphisms in the promoter or 3′untranslated regions of the gene[J].International Journal of Immunogenetics，2005，33：17-20.

[5] 郭峰，錢寶華，張樂之.現(xiàn)代紅細胞免疫[M].上海：第二軍醫(yī)大學出版社，2002.pp1.

[6] 李宏全，黃芪多糖的提純工藝及對紅細胞免疫功能的調節(jié)[D]，山西：山西農業(yè)大學，2008年6月

[7] Nardin A，Lindorfer MA，Taylor RP.How are immune complexes bound to the primate erythrocyte complement receptor transferred to acceptor phagocytic cells.Mol Immunol，2009，36（13-14）：827-35.

[8] Horakova E，Gasser O，Sadallah S，et al.Complement Mediates the Binding of HIV to Erythrocytes[J]. The Journal of Immunology，2004，173：4236-4241.

[9] Hament JM，van Dijk H，F(xiàn)leer A，et al.Pneumococcal immune adherence to human erythrocytes[J].Eur J Clin Invest，2003，33（2）：169-75.

[10] 馬騫寰，黃芪多糖對紅細胞調控T淋巴細胞活性的影響[D]，山西：山西農業(yè)大學，2008年6月

[11] 郭峰，張樂之，薛春燕，等.肝炎患者紅細胞免疫分子CR1定量與循環(huán)免疫復合物的變化[J].深圳中西醫(yī)結合雜志，2004，11（6）：342-343.

[12] 馬海利，韓惠瑛，王勝，鄭明學，李宏全，寧官保，中國預防獸醫(yī)學報，附紅細胞體自然感染對豬紅細胞的影響，2003年，第25卷第4期