屈新輝 劉春發(fā) 胡建新 何 丹 項(xiàng)正兵 吳曉牧

1.江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西南昌 330006；2.江西省神經(jīng)病學(xué)研究所，江西南昌 330006；3.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌 330006；4.江西省人民醫(yī)院藥劑科，江西南昌 330006

免疫學(xué)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展極為迅速的學(xué)科之一，疾病發(fā)生發(fā)展很多都與免疫功能有關(guān)，某些腫瘤患者在放療、化療后或一些病毒感染后致免疫性力低下，但臨床增強(qiáng)免疫力有明顯臨床療效的藥物卻不多見。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為“正虛邪擾”，疾病與人體的抵抗力密切相關(guān)，并且臨床處方運(yùn)用扶正祛邪的法則治療疾病，臨床觀察亦有療效，許多學(xué)者研究了多種單味藥對免疫功能的調(diào)節(jié)作用，嘗試發(fā)現(xiàn)、提取、合成能調(diào)節(jié)免疫的化合物，本實(shí)驗(yàn)旨在從細(xì)胞及分子水平出發(fā)，探求中藥復(fù)方對免疫功能增強(qiáng)的作用及效能，在扶正固本、活血益氣的中藥中遴選出有廣闊應(yīng)用前景的促進(jìn)免疫的中藥復(fù)方。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥的制備

復(fù)方中藥（由西洋參、黃芪、枸杞、當(dāng)歸等多味藥）組成，按總量400 g（西洋參96 g、黃芪96 g、枸杞128 g、當(dāng)歸80 g）稱取處方各藥（由江西省人民醫(yī)院藥劑科供應(yīng)），加蒸餾水400 mL，浸泡24 h，隔水煮1 h，濾過藥液，藥渣再加蒸餾水適量，煮1 h，濾出藥液，合并兩次藥液，隔水濃縮至400 mL，即每1 mL相當(dāng)于1 g生藥的原液，滅菌封存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 周齡昆明小鼠 50 只，體重（20±2）g，雌雄各半，均購自江西中醫(yī)學(xué)院。動(dòng)物自由飲食、飲水，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：JIDW NO.2012-0041。試驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合2006年科技部關(guān)于對試驗(yàn)動(dòng)物的有關(guān)規(guī)定[1]。

1.1.3 試劑與儀器

免疫抑制劑環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：12030625），為 200 mg/支的粉針劑；小鼠IgG和補(bǔ)體C3的ELISA檢測試劑盒為西唐生物公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品（批號(hào)分別為：1208061、1208201）；Anti-MouseCD3（PE-Cy5）、Anti-MouseCD4（FITC）、Anti-Mouse CD8 （PE）、Anti-Mouse CD19 （PE）、Anti-MouseCD49（FITC）、Anti-MouseIL-2（PE）、Anti-MouseIFN-γ（FITC）熒光抗體 （購于eBioscience Inc.San Diego，CA公司，批 號(hào) 分 別 為 E06065-1630、E00077-1630、E01036-1633、E01047-1630、E00752-1630、E02060-1630、E00862-1631）；BECKMAN COULTER流式細(xì)胞儀；酶標(biāo)儀（550 型）；倒置顯微鏡（Leica）；光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS）；紅細(xì)胞裂解液（實(shí)驗(yàn)室制自備）；PBS緩沖液（實(shí)驗(yàn)室制自備）；16號(hào)小鼠灌胃針；Allegra 64R低速冷凍離心機(jī) （BECKMAN COULTER，rmax=204 mm）；HC電子天平（0.1 g）、sarrorious 電子天平（0.001 g），300目金屬篩網(wǎng)。

1.2 方法

1.2.1 藥物急性毒理試驗(yàn)

該復(fù)方中藥各組份臨床應(yīng)用廣泛，未見明顯毒副作用，因此用小鼠灌胃最大容量0.4 mL/10 g[2]來檢查藥物的LD50，取20只小鼠，每次灌胃復(fù)方中藥0.8 mL，2次/d，觀察 15 d，無一死亡，可見 LD50＞ 0.4 mL/10 g。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行隨機(jī)將動(dòng)物分為5組：正常對照組、模型對照組、低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組。每組10只，雌雄各半。將需隨機(jī)分組的雌雄性小鼠分別稱重，按序編號(hào)記錄體重結(jié)果，給每只小鼠鼠分配一個(gè)隨機(jī)數(shù)，按隨機(jī)數(shù)字大小升序排序，按排序后的順序依次將小鼠分入各個(gè)劑量組 。各組體重均值再做F檢驗(yàn)（單因素方差分析），需滿足P＞0．05，如果條件不能滿足，則重復(fù)以上過程，直到滿足為止。隨機(jī)分組結(jié)束后，分別按各組的原始編號(hào)編上實(shí)驗(yàn)編號(hào)。

1.2.3 小鼠免疫抑制模型

建立小鼠免疫抑制模型一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺200 mg/kg，造模完成[3]，正常對照組注射環(huán)磷酰胺溶劑生理鹽水4 mL/kg。

1.2.4 給藥方法

中藥治療組于環(huán)磷酰胺造模后第2天開始用中藥按小鼠體重灌胃，高劑量中藥組灌中藥0.04 mL/g，中劑量中藥組灌中藥0.02 mL/g+蒸餾水0.02 mL/g，低劑量中藥組灌中藥0.01 mL/g+蒸餾水0.03 mL/g，正常對照組、模型對照組均灌蒸餾水0.04 mL/g，喂服14 d。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測

1.2.5.1 體重和脾臟指數(shù) 各組小鼠稱量體重，于試驗(yàn)結(jié)束后斷頸處死，取脾臟，用電子天平稱濕重，計(jì)算脾指數(shù)，脾臟指數(shù)=100%脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量（g/g）。

1.2.5.2 IgG和補(bǔ)體C3的檢測 于試驗(yàn)第14天摘取眼球取血，室溫放置2 h后3000 r/min離心10 min將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離，離心得血清后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書方法檢測小鼠血清IgG和補(bǔ)體C3水平。

1.2.5.3 脾淋巴細(xì)胞 CD3、CD4、CD8、CD19、CD49b NK細(xì)胞、細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ檢測 第14天取小鼠脾臟研磨成單細(xì)胞懸液經(jīng)篩網(wǎng)過濾于離心管中離心，棄上清再加入紅細(xì)胞裂解液離心，棄上清后加入PBS定容至1 mL，用倒置相差顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為 1×107～10×107個(gè)， 加入標(biāo)記抗小鼠 CD3、CD4、CD8、CD19、CD49b NK 細(xì)胞、 細(xì)胞因子 IL-2、IFN-γ熒光抗體抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子指標(biāo)的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析，所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。將資料進(jìn)行正態(tài)性分析和Levene法方差齊性檢驗(yàn)，行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane法檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重和脾指數(shù)結(jié)果比較

正常對照組和模型對照組與各治療組第1天的體重均值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.216＞0.05），表明隨機(jī)分組成功。第14天的體重模型對照組比正常對照組減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.020＜0.05），而模型對照組與各治療組體重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.126、0.904、0.796，均 P ＞ 0.05），表明小鼠免疫抑制后引起體重減輕，而各復(fù)方中藥治療組對免疫抑制小鼠體重?zé)o影響。脾指數(shù)模型對照組比正常對照組降低（P=0.0001＜0.05），而模型對照組與各治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.967、0.255、0.941 ＞ 0.05），表明小鼠免疫抑制后引起脾指數(shù)降低，而各復(fù)方中藥治療組對免疫抑制小鼠脾指數(shù)無影響。見表1。

表1 各組體重和脾指數(shù)比較（x±s）

2.2 各組抗體IgG、補(bǔ)體及CD19結(jié)果比較

模型對照組比正常對照組IgG顯著增高（P=0.002＜0.01），C3顯著降低（正態(tài)分布方差不齊t檢驗(yàn)，P=0.011＜0.05），而低劑量中藥組與模型對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001＜0.01），表明低劑量中藥組能顯著降低免疫抑制小鼠抗體IgG的濃度，升高免疫抑制小鼠補(bǔ)體C3濃度。見表2。

表2 抗體、補(bǔ)體及B淋巴細(xì)胞表面抗原CD19結(jié)果比較（x±s）

2.3 各組脾淋巴細(xì)胞 CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋結(jié)果比較

CD3+、CD4+、CD8+模型對照組均值均低于正常對照組 （P ＜ 0.05），CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+模型對照組水平與低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），顯示復(fù)方中藥對特異性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞免疫無促進(jìn)作用。見表3。

表3 T淋巴細(xì)胞表面抗原結(jié)果比較（x±s）

2.4 各組脾淋巴細(xì)胞CD49b+結(jié)果比較

CD49b+、IL-2、IFN-γ 模型對照組水平均低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組均值均增高，但僅低劑量中藥組CD49b+與模型對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008＜0.01），表明小劑量復(fù)方中藥對免疫抑制小鼠非特異性免疫NK細(xì)胞有免疫促進(jìn)作用。IL-2、IFN-γ低劑量中藥組、中劑量中藥組與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（IL-2：P=0.004、P=0.039；IFN-γ：P=0.026、P=0.024，P ＜ 0.05或P＜0.01），表明小劑量、中劑量復(fù)方中藥對免疫抑制小鼠非特異性免疫細(xì)胞因子IL-2及IFN-γ有免疫促進(jìn)作用。見表4。

表4 各組NK細(xì)胞及細(xì)胞因子比較（%，x±s）

3 討論

機(jī)體的免疫功能主要與T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、NK自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞及抗體、補(bǔ)體、免疫細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子有關(guān)。特異性免疫與T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞活化產(chǎn)生的抗體有關(guān)，非特異性免疫與單核巨噬細(xì)胞、NK自然殺傷有關(guān)，而補(bǔ)體及細(xì)胞因子廣泛參與特異性免疫與非特異性免疫。根據(jù)中醫(yī)藥理論和現(xiàn)代藥理研究表明：西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清熱生津，主要活性成分為皂苷類、多糖類和氨基酸類等，其中的活性多糖可以通過激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、補(bǔ)體、激活巨噬細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞，誘生多種免疫因子等途徑對機(jī)體免疫產(chǎn)生廣泛的影響，從而提高機(jī)體免疫力[4]；黃芪益氣固表，能調(diào)節(jié)免疫功能，可治療氣虛感冒；枸杞滋補(bǔ)肝腎，能提高機(jī)體免疫功能，延緩抗衰老，長期服用可增強(qiáng)免疫功能；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，具有抗炎和改善血管功能的作用[5]。本文以常用補(bǔ)益劑西洋參、黃芪、當(dāng)歸、枸杞組成的復(fù)方中藥湯劑為研究對象，全方具有補(bǔ)氣活血、滋補(bǔ)肝腎，滋陰益陽作用，觀察其對免疫器官、免疫細(xì)胞、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子等不同層面免疫功能的影響，探求其增強(qiáng)免疫的機(jī)制。

正常對照組和模型對照組與各治療組第1天的體重均值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明隨機(jī)分組成功。環(huán)磷酰胺為常有免疫抑制劑，為細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒藥物，其免疫抑制機(jī)制為對骨髓強(qiáng)大抑制作用，致T、B淋巴細(xì)胞絕對數(shù)量減少，并抑制淋巴細(xì)胞受特異性抗原刺激后母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[6]。本實(shí)驗(yàn)采用其制作免疫抑制動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察到體重、脾指數(shù)、CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、NK 細(xì)胞、補(bǔ)體C3、細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ均降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明建立免疫抑制動(dòng)物模型成功。模型對照組與各治療組體重和脾指數(shù)無差異（P＞0.05），各復(fù)方中藥治療組對免疫抑制小鼠體重和脾指數(shù)無影響，表明其在免疫器官層面無顯著性作用。脾指數(shù)模型對照組比正常對照組降低（P=0.0001），可能與促進(jìn)免疫器官的生長作用因環(huán)磷酰胺對機(jī)體抑制作用過強(qiáng)而顯現(xiàn)不出來有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)觀察復(fù)方中藥各劑量組與模型組比較對CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD19+均無差異，因此未能證實(shí)其對特異性細(xì)胞免疫及體液免疫有促進(jìn)作用。以往有報(bào)道西洋參多糖對60℃射線照射致免疫抑制模型小鼠可增強(qiáng)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)能力[7]；黃芪多糖對正常小鼠可增強(qiáng)Con A誘導(dǎo)的小鼠脾T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力[8]；當(dāng)歸多糖明顯促進(jìn)健康人外周血T淋巴細(xì)胞增殖[9]；枸杞多糖明顯增強(qiáng)植物凝集素PHA活化的人外周血淋淋巴細(xì)胞的增殖[10]。復(fù)方中藥中四種單味藥均可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞免疫力，而組成的復(fù)方反而未得出促進(jìn)T淋巴細(xì)胞免疫的結(jié)論，這可能與免疫模型不同引起藥物對機(jī)體敏感性不同有關(guān)，還與觀察T淋巴細(xì)胞指標(biāo)不同及檢測方法不同有關(guān)。

補(bǔ)體是存在于血清和組織液中經(jīng)活化后具有酶活性的蛋白質(zhì)，補(bǔ)體成分可與多種免疫細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，補(bǔ)體C3等可參與固定抗原，使抗原易被APC處理與遞呈，參與免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，并參與清除免疫復(fù)合物及免疫記憶，補(bǔ)體系統(tǒng)是具有重要生物學(xué)作用的效應(yīng)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)。補(bǔ)體途徑分為經(jīng)典、替代和外源凝集素途徑[11]，補(bǔ)體C3是補(bǔ)體激活的三個(gè)級(jí)聯(lián)的一個(gè)關(guān)鍵組成部分[12]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇補(bǔ)體C3指標(biāo)作為觀察補(bǔ)體系統(tǒng)功能。低劑量中藥組與模型對照組比較補(bǔ)體C3顯著升高（P=0.0001＜0.01），表明低劑量中藥組能顯著升高免疫抑制小鼠補(bǔ)體C3濃度，顯著促進(jìn)免疫抑制小鼠補(bǔ)體系統(tǒng)的功能。

本實(shí)驗(yàn)免疫抑制模型對照組與正常對照組比較抗體IgG是升高的，差異有高度統(tǒng)計(jì)意義（P=0.002），而高劑量中藥組、中劑量中藥組、低劑量中藥組IgG均值依次降低，且低劑量中藥組與模型對照組比較，差異顯著（P值=0.001），表明低劑量中藥組能顯著降低免疫抑制小鼠抗體IgG的濃度。機(jī)體抗原免疫后血清中的抗體其中IgM檢出時(shí)間最早，IgG檢出時(shí)間較晚但存留時(shí)間最長，IgA檢出時(shí)間最晚[13]。本實(shí)驗(yàn)B淋巴細(xì)胞抗原CD19+在免疫抑制后下降，因IgG產(chǎn)生時(shí)間較晚但存留時(shí)間最長，在實(shí)驗(yàn)14 d的時(shí)間節(jié)點(diǎn)上，IgG主要是造模前存留的，因此理論上模型組與正常對照組應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通常抗原與抗體結(jié)合，在補(bǔ)體的參與下，抗原與抗體結(jié)合產(chǎn)生幾何級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，清除抗原的同時(shí)消耗了抗體，補(bǔ)體升高會(huì)導(dǎo)致抗體降低，補(bǔ)體降低也會(huì)導(dǎo)致抗體升高。本實(shí)驗(yàn)免疫抑制后對補(bǔ)體也造成了強(qiáng)大的抑制，因而出現(xiàn)正常對照組IgG抗體低，模型組IgG抗體升高。本實(shí)驗(yàn)B淋巴細(xì)胞抗原CD19+各中藥治療組與模型組無差異，其一定程度上反映了機(jī)體體液免疫功能，體液免疫產(chǎn)生的抗體理論上亦無差異，因此認(rèn)為低劑量中藥組IgG降低是因?yàn)榈蛣┝繌?fù)方中藥可顯著升高補(bǔ)體所引起的。

NK自然殺傷細(xì)胞對病原體無嚴(yán)格選擇性，能識(shí)別多種病原體的共有成分，對多種病原體均有吞噬、殺傷作用。NK細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN-γ主要的先天免疫細(xì)胞，NK細(xì)胞不需要事先暴露于抗原發(fā)揮其功能，通過自然的細(xì)胞毒性和的分泌細(xì)胞因子發(fā)揮防止微生物的侵襲和傳播的重要的免疫效應(yīng)，NK細(xì)胞是天然免疫和獲得性免疫功能之間的橋梁，先天第一線防御癌癥和病原體的入侵的關(guān)鍵[14]。CD49是小鼠NK細(xì)胞主要標(biāo)志物，本實(shí)驗(yàn)選用其作為觀察NK細(xì)胞的功能指標(biāo)。復(fù)方中藥低劑量組與模型組比較可顯著升高CD49（P=0.008＜0.01），顯示低劑量復(fù)方中藥能有效促進(jìn)NK自然殺傷細(xì)胞數(shù)量。在此需要說明的是復(fù)方中藥表現(xiàn)出的對機(jī)體免疫促進(jìn)作用并不是由于中和環(huán)磷酰胺的藥效而引起的，因?yàn)榄h(huán)磷酰胺的半衰期為4 h，24 h后已經(jīng)過了6個(gè)半衰期，機(jī)體環(huán)磷酰胺的血藥濃度僅有1/64，因此24 h后喂服中藥不存在中和環(huán)磷酰胺的藥效，表明小劑量復(fù)方中藥對免疫抑制小鼠非特異性免疫NK細(xì)胞有免疫促進(jìn)作用。

輔助性Th1細(xì)胞受抗原刺激分泌細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ，IL-2刺激CTL細(xì)胞增殖與分化，IFN-γ可誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞等MHCⅡ類抗原的表達(dá)，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識(shí)別過程；IFN-γ還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表面受體Fc的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體和腫瘤細(xì)胞[15]；IL-2和IFN-γ都可以增強(qiáng)NK細(xì)胞細(xì)胞毒活性。因此IL-2和IFN-γ是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中劑量中藥組及低劑量中藥組與模型組比較均能升高IL-2和IFN-γ（P＜0.05），表明一定劑量范圍的復(fù)方中藥對免疫細(xì)胞因子有促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)復(fù)方中藥藥理毒理試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用，但高劑量中藥組對所有免疫指標(biāo)均無促進(jìn)作用，說明藥物劑量過大對機(jī)體還是有一定的不利影響，中藥中既使補(bǔ)益藥，也有一定的副作用。雖然都是補(bǔ)氣養(yǎng)陰活血的補(bǔ)益藥，正應(yīng)了中醫(yī)理論有“氣有余便是火”，補(bǔ)氣有余易產(chǎn)生火邪。

因此，復(fù)方中藥（由西洋參、黃芪、枸杞、當(dāng)歸等多味藥組成）在一定劑量范圍內(nèi)，雖然還未能證實(shí)對機(jī)體特異性細(xì)胞免疫和體液免疫有促進(jìn)作用，但對非特異性細(xì)胞免疫及體液免疫有顯著促進(jìn)作用。

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