鄭冬超，王 甜，李媛媛，王雨昊，王 男，汪 紅，曹 瑜

細(xì)菌芽孢染色法的改良探索

鄭冬超，王 甜，李媛媛，王雨昊，王 男，汪 紅，曹 瑜

（四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，成都 610065）

文中對微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教材上介紹的Schaeffer－Fulton氏芽孢染色法進(jìn)行了改進(jìn)。用石碳酸復(fù)紅試劑代替0.5番紅水溶液作為復(fù)染劑，并對比不同石碳酸復(fù)紅濃度及染色時(shí)間對染色效果的影響。結(jié)果表明，以石碳酸復(fù)紅的10倍稀釋液為復(fù)染劑，復(fù)染30 s～1 min時(shí)能達(dá)到最佳的染色效果。改進(jìn)方法操作簡單易行，染色效果對比鮮明，可使學(xué)生更易將菌體與芽孢區(qū)分開來。將改進(jìn)的染色方法運(yùn)用于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，收到了良好的教學(xué)效果。

細(xì)菌；芽孢染色；石炭酸復(fù)紅；番紅

芽孢（spore）是指某些細(xì)菌（主要是芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌）在一定的環(huán)境條件下，在菌體內(nèi)部形成的圓形或卵圓形小體，是細(xì)菌的休眠方式，稱為內(nèi)芽孢（endospore），簡稱芽孢。能否形成芽孢，以及芽孢的形狀、大小、位置、是否膨脹等形態(tài)特征，是鑒別細(xì)菌種類的重要依據(jù)［1］。芽孢具有厚而致密的壁，通透性小，不易被普通染料著色。所有芽孢染色法都首先選用著色力強(qiáng)的染料，并加熱以促進(jìn)樣品著色；然后，使菌體脫色，保留芽孢上的染料；最后，使用不同顏色的復(fù)染劑進(jìn)行復(fù)染，使菌體和芽孢呈不同的顏色［2］。芽孢染色是細(xì)菌分類的重要指標(biāo)，是本科院校開設(shè)《微生物》課的學(xué)生必須熟練掌握的微生物染色技術(shù)，現(xiàn)有的微生物實(shí)驗(yàn)教材上介紹的染色方法是Schaeffer－Fulton氏染色法［3－7］。但該方法采用孔雀綠作為初染劑，0.5番紅水溶液作為復(fù)染劑，染色后普遍存在芽孢、菌體著色度及對比度不明顯，易褪色等缺點(diǎn)［8］。本研究以石碳酸復(fù)紅溶液代替番紅試劑作為復(fù)染劑，并尋找最佳的染色時(shí)間，從而推導(dǎo)出最佳染色效果的組合條件，目的是使學(xué)生能更快、更好地進(jìn)行芽孢染色，清楚細(xì)致地區(qū)分菌體和芽孢的結(jié)構(gòu)，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)36～48 h的斜面培養(yǎng)物。

1.1.2 染色劑

石碳酸復(fù)紅溶液的配制如下：

B液：石碳酸5.0 g，蒸餾水95 mL，將石碳酸溶解于水中，配成B液；將A液及B液混合即成。

1.1.3 儀器設(shè)備

酒精燈，載玻片，接種環(huán)，載玻片夾子，O-lympus顯微影像分析系統(tǒng)（1 130萬像素?cái)?shù)碼CCD、最高分辨率1 280×1 024）。

1.2 方法

分為制片—初染—脫色—復(fù)染—鏡檢五個(gè)步驟：即取適量培養(yǎng)好的枯草芽孢桿菌斜面菌種，常規(guī)涂片、干燥、固定，滴加5孔雀綠覆蓋涂菌部位，加熱至冒蒸汽并維持8 min，注意及時(shí)補(bǔ)充染液，切勿讓涂片干涸。待玻片冷卻后，用緩流自來水沖洗至流出水呈現(xiàn)無色狀態(tài)。用0.5番紅或稀釋5倍、10倍、15倍及20倍的復(fù)紅溶液分別染色30 s、1 min、1.5 min、2 min。待載玻片晾干后，用油鏡鏡檢并進(jìn)行顯微攝像。對比芽孢和菌體顏色深淺、對比度、背景清晰度等，客觀評(píng)價(jià)染色效果，將染色結(jié)果分為優(yōu)、良、中、差四個(gè)等級(jí)，以芽孢菌體對比度強(qiáng)、背景清晰為優(yōu)。每種濃度及復(fù)染時(shí)間的組合實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)三次。

2 結(jié)果與分析

以芽孢和菌體顏色深淺、對比度、背景清晰度等為標(biāo)準(zhǔn)，對不同濃度復(fù)染劑及復(fù)染時(shí)間組合下的芽孢染色效果進(jìn)行了客觀評(píng)價(jià)，結(jié)果如表1所示。

圖1 各種復(fù)染劑及復(fù)染時(shí)間組合下芽孢染色差異

表1 各種復(fù)染劑及復(fù)染時(shí)間組合下芽孢染色效果

3 結(jié)束語

目前，已有不少文獻(xiàn)對初染過程進(jìn)行改進(jìn)，如將初染的加熱方法改進(jìn)為水浴蒸汽加熱、烘箱加熱［9］、濾紙覆蓋加熱［10］或微波爐加熱［11－12］等，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的酒精燈加熱，從而簡化操作步驟，減少了染色時(shí)間，并使得染色效果更為突出。但是，針對復(fù)染過程進(jìn)行改進(jìn)的研究報(bào)道較少。

［1］沈萍，陳向東.微生物學(xué)［M］.2版.北京：高等教育出版社，2006：53－59.

［2］朱陶，付燦.幾種芽孢染色方法的比較與改進(jìn)［J］.井岡山學(xué)院學(xué)報(bào)：綜合版，2008，29（8）：149－150.

［3］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.3版.北京：高等教育出版社，2007：76.

［4］陳金春，陳國強(qiáng).微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：清華大學(xué)出版社，2005：72.

［5］趙斌，何紹江.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京：科學(xué)出版社，2002：42－43.

［6］楊革.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.北京：科學(xué)出版社，2004：22－23.

［7］唐麗杰.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社，2005：41.

［8］楊健，何永林，劉曄華.微生物教學(xué)中常用細(xì)菌染色方法的改進(jìn)［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，18（4）：165.

［9］葉生梅，高威.細(xì)菌芽孢染色方法改進(jìn)研究［J］.微生物學(xué)雜志，2011，31（1）：106－109.

［10］胡洪杰，王玉，施魯?shù)眩?抗酸染色和芽孢染色的改良型濾紙覆蓋加熱法［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2009，4（1）：51－65.

［11］袁紅，倪有娣，繆利英，等.介紹一種細(xì)菌芽孢微波染色法［J］.杭州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2002，23（5－6）：236.

［12］趙世鴻，夏世平，向麗，等.炭疽桿菌芽孢染色法的改進(jìn)［J］.中國誤診學(xué)雜志，2004，4（9）：1429－1430.

A M odified Bacterial Spore Staining M ethod

ZHENG Dongchao，WANG Tian，LIYuanyuan，WANG Yuhao，WANG Nan，WANG Hong，CAO Yu
（School of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610065，China）

Schaeffer－Fulton's spore staining method introduced in the textbooks of experimental microbiology was optimized in our study.0.5safranine solution dyewas replaced by carbolfuchsin dye，and the staining effectswere explored in terms of carbolfuchsin concentrations and staining time.The results showed that the best staining results could be achieved with 1/10 carbolfuchsin dye，staining 30 seconds to 1 minute.The improved method was easy to operate，the staining effectwas obvious，and the structure ofmycelium and spore was easier to be distinguished.This method has been put into microbiological experiment teaching，and achieved better teaching results.

bacteria；spore staining；carbolfuchsin；sarranine

Q93－333

A

10.3969/j.issn.1672－4550.2014.05.008

2014－01－25；修改日期：2014－03－31

四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)基金資助項(xiàng)目（2013－114）；國家微生物資源平臺(tái)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（NIMR－2014－8）。

鄭冬超（1985－），女，博士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作。

曹 瑜（1984－），女，博士，主要從事微生物資源挖掘保藏等相關(guān)科研工作。