史堅強，陳太平，張國強，季 昶，曹根寶，吳述良，張 清，崔 磊＊＊，仇海燕

(1.中國人民解放軍第86醫(yī)院外二科，安徽 馬鞍山 243100 2.江蘇大學附屬醫(yī)院普外科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

胰腺癌惡性程度極高，確診后生存率很低，是美國癌癥病死亡原因的第四位或第五位，占胃腸道癌癥死亡的1/5［1］。由于胰腺位于腹膜后，癥狀、體征的不明顯和不典型使之難以得到早期治療，臨床治療效果差［2］，總的5年生存率僅為5%左右。目前，手術切除癌腫是治療早期胰腺癌唯一有效的根治方法，而放化療等綜合性治療的效果均不滿意。因此，分子水平研究原發(fā)性胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展和復發(fā)、轉移及耐藥性機制，已成為當今胰腺癌研究中的熱點和難點。本研究擬利用流式細胞儀分選(FCM Sorting)技術從原代胰腺癌組織中分選出CD133+/ABCG2+的細胞群，并且通過相關實驗來檢測分析其特異性指標，從而確定該群細胞在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉移中的作用，為后續(xù)腫瘤化療藥物的篩選提供有效模型。

1 材料與方法

1.1 CD133+/ABCG2+人胰腺癌亞群細胞的篩選：無菌條件下收集胰腺癌患者手術中切除的腫瘤組織，用PBS清洗組織2次，剪去除組織中的壞死組織等，將腫瘤組織浸泡于青霉素(1000U/mL)和鏈霉素(1000U/mL)混合液中10min。棄去浸泡液，將腫瘤組織剪成直徑1mm的組織小塊，然后加入5倍體積的胰酶消化液(0.25%胰酶含0.02%EDTA)，于37℃環(huán)境下震蕩消化30min。隨后，加入5倍體積的含10%胎牛血清的細胞完全培養(yǎng)基加以終止，上下顛倒震蕩使細胞脫落，過200目篩網(wǎng)，于1500r/min離心5min。收集細胞沉淀，加入100μL預冷的PBS緩沖液，隨后加入rabbit anti-human CD133-FITC和rabbit anti-human ABCG2-PE monoclonal antibodies(eBioscience生物科技有限公司)各4μL，并于4℃環(huán)境中避光孵育30min。利用流式細胞儀(BD FACSAria，BD Bio-science，CA，USA)將CD133+/ABCG2+和CD133-/ABCG2-分選出來，并懸浮于無血清的干細胞培養(yǎng)基［DMEM/F12，10ng/mLbasic fibroblast growth factor(bFGF)，10 ng/mL epidermal growth factor(EGF)，5μg/mL insulin和0.5%bovine serum albumin(BSA)，上述試劑均購于Sigma-Aldrich試劑公司］中，在37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 RNA抽提與實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測：按Tr-Izol Reagent說明書的步驟，抽提各組細胞的Total RNA，并且利用ReverTra Ace M-mLVReverse Transcriptase和寡核苷酸引物Oligo(dT)18經(jīng)RT-PCR生成對應的cDNA。測定其濃度，-20℃保存。以上述反轉錄獲得的cDNA作為模板，在Eppendorf RealPlex4(Eppendorf CO.，LTD)上，利用兩步法進行qRT-PCR，根據(jù)相對定量法(mRNA的相對變化量Ratio=2-ΔΔCt︱ ΔΔCt=［ΔCt_CD133+/ABCG2+-ΔCt_CD133-/ABCG2-］)計算目標片段的擴增比例。擴增產(chǎn)物以2%的Agrose Gel電泳進行分析。檢測中設立空白對照(blank control)，均以ddH2O作為模板，各樣本設立3個重復，以18SrRNA作為內(nèi)參。

1.3 免疫熒光(IF)鑒定：各組細胞用 PBS(0.02 moL/L，pH7.4)清洗2次，然后用4%多聚甲醛溶液常溫下固定20min固定液，用封閉液(0.02mol/L PBS中加入0.2%Triton-100和5%正常山羊血清)在37℃下封閉60min。棄封閉液，用PBST(0.02mol/L PBS中加入0.2%Triton-100)漂洗3次，每次5min。棄廢液，加入一抗(rabbit anti-human Oct3/4 antibody;rabbit anti-human Nanog antibody;Santa Cruz公司)，于37℃下孵育45min。反應完畢后，用PBST漂洗3次，每次10min，然后加入熒光標記二抗(goat anti-rabbit Cy3-conjection antibody;Santa Cruz公司)及DAPI，于37℃下避光孵育45 min。反應結束后，用PBST漂洗3次，用50%丙三醇封片，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.4 軟瓊脂(Soft Agar)克隆集落形成實驗：在42℃水浴中，將存儲濃度為1.2%的低熔點瓊脂糖與2×細胞完全培養(yǎng)基以1：1(v/v)混合，形成終濃度0.6%的底層瓊脂，取1.4mL加入6孔板的一個孔中。待完全凝固后，取對數(shù)期細胞吹打成單細胞懸液，并調細胞濃度為2×104/mL。再將存儲濃度為0.6%的低熔點瓊脂糖與2×細胞完全培養(yǎng)基以1：1(v/v)混合，形成終濃度為0.3%的上層瓊脂，取1.0mL上層瓊脂與0.1mL細胞懸液充分混勻，加入已有下層瓊脂的6孔板中，待其凝固后，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周，計算細胞克隆集落形成率。

1.5 MTT比色法檢測腫瘤干細胞耐藥性：各組細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(密度為2×103)。在藥物組孔中分別加入30nmoL/μL的順鉑和35nmoL/μL的吉西他濱，而陰性對照組中分別加入等體積的PBS緩沖液，置于37℃，5%CO2環(huán)境中分別培養(yǎng)24，48，96h。在檢測前的 4h 加入 MTT 20μL(5mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心去上清且加入DMSO溶解沉淀。用酶標儀在490nm處讀取所對應的吸光度值(D490)，設立3個復孔，取其平均值。測得各孔吸光度數(shù)值，利用公式：(1-實驗組D值/對照組D值)×100%，計算出藥物對于細胞的增殖抑制率。

1.6 Western blot檢測：收集各組細胞，根據(jù) Western blot Kit說明書中的步驟，抽提各組細胞的總蛋白，利用Lowry法測定總蛋白濃度，以每個泳道20μg濃度的蛋白樣品上樣，經(jīng)30%變性SDS-PAGE電泳后，利用半干電轉化法將蛋白轉移至PVDF膜上，經(jīng)過封閉、一抗(稀釋倍數(shù)1：1000)孵育、PBST洗脫、HRP標記的二抗(稀釋倍數(shù)1：500)孵育、PBST再洗脫等步驟后，ECL化學發(fā)光及X光片暴光，并且經(jīng)定影顯影處理，獲得清晰條帶。利用BandScan軟件分析各條帶的A值。

1.7 裸鼠致瘤實驗：收集各組細胞、離心、收集沉淀，利用冰預冷的PBS重懸細胞，調整至細胞密度為10000/μL。取2只裸鼠(購自上海斯萊克實驗動物中心)，分別于背部皮下組織注射20μL細胞懸液，其中1只注射CD133+/ABCG2+細胞，另1只注射CD133-/ABCG2-細胞。所有裸鼠均飼養(yǎng)于相同的環(huán)境(SPF級)中，每周觀察一次背部瘤體形成情況。

1.8 亞硫酸氫鈉處理及甲基化特異性PCR(MS-PCR)鑒定ABCG2啟動子甲基化：抽提各組細胞的基因組 DNA，并按CpGeno-meTM DNA Modification Kit說明書的步驟完成基因組DNA的體外修飾。取各組細胞重亞硫酸鹽修飾后的基因組DNA(2μL)作為模板，同時在PCR管中分別加入上下游引物(0.01nmoL)各0.5μL、2 × HotStart Taq PCR MasterMix 10μL 及ddH2O7μL，使得MS-PCR總反應體系為20μL。根據(jù)引物序列及PCR反應過程及溫度進行MS-PCR檢測。PCR反應完成后，其產(chǎn)物進行1.5%瓊脂塘凝膠檢測，并且利用BandScan軟件分析各條帶的A值。

2 結果

2.1 CD133+/ABCG2+亞群細胞高表達干細胞標志：本研究中，我們共收集了3例胰腺癌患者的手術切除腫瘤組織(編號為：PC1-PC3)，都為胰腺導管腺癌，病理分期為Ⅱ期。通過胰酶消化和流式細胞分選技術，我們從胰腺癌組織中獲取了CD133+/ABCG2+的細胞亞群。經(jīng)過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌原代細胞中，CD133+/ABCG2+細胞亞群所占的比例非常小，而絕大多數(shù)腫瘤細胞為CD133-/ABCG2-細胞(占總細胞數(shù)的)。原代的CD133+/ABCG2+和CD133-/ABCG2-均以無血清培養(yǎng)基在體外進行懸浮培養(yǎng)(suspended cultured)，當傳代至第9代的時候，CD133-/ABCG2-出現(xiàn)大量的死亡細胞，而CD133+/ABCG2+細胞成團生長，其中細胞顆粒小且密集，折光度好，顯示出非常好的生長狀態(tài)(圖1)。我們利用qRT-PCR檢測了各類細胞群干細胞生物標志(bio markers)表達情況，實驗結果表明，CD133+/ABCG2+細胞群較CD133-/ABCG2-細胞群高表達SoX2、Oct4等干細胞標志(圖2)。同時，Western blot和免疫熒光(IF)檢測也同樣顯示了CD133+/ABCG2+細胞群較CD133-/ABCG2-細胞群高表達干細胞生物標志(圖3)。實驗證實，CD133+/ABCG2+細胞群具有典型的干細胞特性。

2.2 CD133+/ABCG2+亞群細胞在體外增殖能力明顯增強且具有高侵襲性：選擇第7代的細胞，每2d統(tǒng)計一次細胞的增殖數(shù)量，連續(xù)計算10d，統(tǒng)計結果表明，CD133+/ABCG2+細胞亞群自第4天起出現(xiàn)明顯的增殖趨勢，而CD133-/ABCG2-亞群細胞至第6天才進入增殖期。結果表明，CD133+/ABCG2+亞群細胞具有很強的自我增殖能力(圖4)。同時，細胞克隆形成實驗證實，CD133+/ABCG2+亞群細克隆形成能力明顯高于CD133-/ABCG2-亞群細胞(圖4)。

圖1 CD133+/ABCG2+的細胞亞群

圖2 CD133+/ABCG2+細胞群較CD133-/ABCG2-細胞群高表達SoX2、Oct4等干細胞標志

圖3 A：0到10d不同組別胰腺癌亞群細胞的體外增殖檢測(MTT);B：不同細胞亞群軟瓊脂集落形成;C：不同細胞對順鉑和吉西他濱耐受性的MTT檢測

圖4 A：qRT-PCR檢測結果;B：Western blot檢測結果。*P＜0.05，＊＊P ＜0.01，#P ＞0.05，n=3。

2.3 CD133+/ABCG2+亞群細胞具有高耐藥性：MTT實驗結果顯示，在順鉑或吉西他濱藥物刺激下，CD133-/ABCG2-細胞呈現(xiàn)出顯著的增殖抑制現(xiàn)象，其增殖抑制強度與化療藥物刺激時間的長短具有明顯的相關性(圖4)。而CD133+/ABCG2+細胞對于順鉑或吉西他濱均表現(xiàn)出很好的耐受性，在各個時間點上，其增殖抑制率均顯著低于CD133-/ABCG2-細胞。結果證實，CD133+/ABCG2+亞群細胞具有較高腫瘤細胞化療藥物耐受性。

2.4 CD133+/ABCG2+亞群細胞具有高致瘤性：選取少量的細胞(約為10000/μL)接種于裸鼠背部皮下。大約在8周之后，CD133+/ABCG2+細胞接種鼠的背部可以觀察到有明顯的瘤體產(chǎn)生，而接種CD133-/ABCG2-細胞的裸鼠背部相同位置上并未發(fā)現(xiàn)有瘤體。繼續(xù)飼養(yǎng)2周，CD133+/ABCG2+細胞接種鼠的瘤體不斷長大，而接種CD133-/ABCG2-細胞的裸鼠背部仍然未發(fā)現(xiàn)有瘤體長出(圖5)。裸鼠體內(nèi)成瘤實驗說明，CD133+/ABCG2+細胞具有典型的腫瘤干細胞強致瘤性的特征。

圖5 左：CD133-/ABCG2-細胞亞群注射組;右：CD133+/ABCG2+細胞亞群注射組;

2.5 多耐藥基因ABCG2啟動子區(qū)域在CD133+/ABCG2+亞群細胞中呈現(xiàn)去甲基化狀態(tài)：兩組細胞的基因組DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，以ABCG2啟動子區(qū)甲基化和非甲基化特異性引物進行MS-PCR檢測。實驗結果顯示，在CD133+/ABCG2+亞群細胞中，ABCG2非甲基化引物PCR結果呈現(xiàn)出陽性條帶，而在CD133-/ABCG2-亞群細胞中，ABCG2非甲基化擴增的PCR產(chǎn)物則無明顯條帶，提示CD133+/ABCG2+細胞亞群中，ABCG2啟動子區(qū)域存在去甲基化現(xiàn)象(圖6)。該實驗證實，CD133+/ABCG2+胰腺癌細胞中，由于ABCG2啟動子去甲基化而導致其高表達，使其具有較強的化療耐藥性。該研究中，利用5-Aza-CdR(10μmol/L)處理細胞，作為MS-PCR檢測的陰性對照。

圖6 ABCG2基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化修飾檢測

3 討論

腫瘤學傳統(tǒng)觀點認為，腫瘤中每個瘤細胞都具有無限增殖和形成克隆瘤灶的的能力，但具體哪個瘤細胞能夠形成新瘤灶是隨機的。而現(xiàn)在頗受關注的“腫瘤干細胞(Cancer Stem Cell)學說”則對此種觀點提出挑戰(zhàn)。該學說認為，腫瘤組織中存在著一小群腫瘤干細胞(或起始細胞);其單個細胞即可發(fā)展為腫瘤，具有干細胞自我更新和多向分化能力等特征。此種學說還認為，腫瘤干細胞是惡性腫瘤形成的起始細胞，維持著腫瘤的生長，可能是腫瘤復發(fā)、轉移、耐藥機制的根源［3，4］。

利用流式細胞術來分選出具有特定分子標志的細胞群體是篩選腫瘤干細胞的經(jīng)典方法。腫瘤學研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞來源于一群邊緣細胞群(Side Population，SP)［5，6］，亦稱之為側群細胞。1996年Goodle等利用流式細胞術研究骨髓細胞的細胞周期時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過Hoechst33342染色后并非所有的細胞都可發(fā)出藍色熒光，而有大約不到0.1%的細胞并未被染料著色。然而，這群細胞卻高度表達干細胞的標記sca1+/Lin-［7］。相關研究同時還指出，SP細胞之所以能夠不被Hoechst33342染色，是由于其高度表達ABCG2蛋白。ABCG2蛋白全稱為ATP結合G蛋白偶聯(lián)超家族泵蛋白成員，其存在可以將一些小分子染料(Hoechst33342、羅丹明123等)及化療藥物等物質通過離子交換形式泵出細胞外，以避免這些物質對細胞生理生化活動的干擾。由此可見，在腫瘤細胞中，ABCG2蛋白的表達情況與腫瘤耐藥性具有密切的聯(lián)系;而腫瘤干細胞之所以高度耐藥，與其細胞膜上ABCG2蛋白的過度表達關系密切［8］。

本試驗中，利用流式細胞儀分選(FCM Sorting)技術從原代胰腺癌組織中分選出CD133+/ABCG2+的細胞群，并且通過細胞體外增殖實驗、耐藥性實驗、軟瓊脂克隆形成實驗、熒光定量PCR及Western Blotting分析其耐藥性、干細胞標志、腫瘤克隆形成率及遷徙特性，結果表明該亞群細胞高表達干細胞標志物(如：Oct4、SoX2)，和普通胰腺癌細胞相比，具有更強的侵襲性和克隆形成能力以及更強的化療耐藥性。另外裸鼠體內(nèi)成瘤實驗表明該亞群細胞具有更強的體內(nèi)成瘤能力。隨后，通過DNA甲基化檢測證實，多耐藥(multi-drug resistant)基因ABCG2啟動子差異性甲基化是導致該細胞呈現(xiàn)出化療藥物耐受性的重要原因。

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