黃秀英，耿嘉男，劉 凱，陳艷芳，劉 暢，雷冬艷，于曉艷，孫 波＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林長春130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春130021）

Clusterin在UUO大鼠模型中的表達(dá)及診斷意義

黃秀英1，耿嘉男2，劉 凱2，陳艷芳2，劉 暢2，雷冬艷2，于曉艷2，孫 波2＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林長春130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春130021）

Clusterin被發(fā)現(xiàn)與許多腎臟損傷有關(guān)，在腎缺血再灌注損傷、有明顯排斥反應(yīng)的腎移植患者以及一些藥物導(dǎo)致的急性腎損傷中Clusterin表達(dá)均有上調(diào)［1］，可作為腎損傷的分子生物標(biāo)志物。單側(cè)輸尿管梗阻（uniliteral ureteral obstruction，UUO）能直接導(dǎo)致腎間質(zhì)炎癥和纖維化等多樣性病理學(xué)改變，而Clusterin的表達(dá)與UUO造成早期腎損傷的關(guān)系尚未見詳細(xì)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬通過大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立急性腎損傷模型，探討Clusterin在早期腎損傷中的變化，觀察Clusterin在UUO大鼠腎組織中和尿液中表達(dá)情況，為早期腎損傷的無創(chuàng)臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠抗Clusterin單克隆抗體（R＆D公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗、通用型二步法免疫組化試劑盒（PV－6000）和DAB顯色劑（北京中杉生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及UUO模型建立

40只健康雄性Wister大鼠（210－230g，吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，大鼠造模前禁食12小時(shí)后乙醚吸入麻醉，仰臥位固定。無菌條件下于左側(cè)中腹部切開皮膚，打開腹腔，在左后腹壁沿腎門向下辨認(rèn)白色細(xì)線狀的輸尿管，游離左側(cè)輸尿管，分別在腎盂處和輸尿管上1／3處用手術(shù)線雙重結(jié)扎，在結(jié)扎線之間切斷輸尿管，逐層縫合腹壁皮膚。右側(cè)不結(jié)扎作為自身對(duì)照，假手術(shù)組僅游離輸尿管但不結(jié)扎［2］。分別于術(shù)后1、3和7d處死大鼠，取腎臟備用。

1.3 免疫組化檢測(cè)UUO大鼠腎臟Clusterin表達(dá)

UUO大鼠腎臟于10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。切片經(jīng)過脫蠟、水化，微波熱修復(fù)，冷卻后經(jīng)3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化酶，血清封閉后依次加入相應(yīng)一抗和二抗后進(jìn)行顯色。Clusterin一抗以1∶100稀釋后加入，滴加二抗以及染色步驟嚴(yán)格按照PV－6000說明書操作。在高倍鏡（×400）下，Clusterin以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽性信號(hào)，每例切片隨機(jī)選5個(gè)腎小管－間質(zhì)染色陽性視野，陽性細(xì)胞染色程度按0－3分計(jì)算：0分，正常；1分，淺黃色；3分，黃褐色；介于二者之間為2分。染色后同時(shí)觀察腎小管間質(zhì)病理改變。

1.4 ELISA檢測(cè)UUO大鼠尿液Clusterin水平

大鼠于造模后第0d－7d每日收集尿液，假手術(shù)組為對(duì)照，尿液離心后取上清包被于96孔酶標(biāo)板（按85μl包被液＋15μl樣品加入），4℃過夜；次日加入1%BSA 150μl／孔封閉1h后洗板3次×3 min；小鼠抗Clusterin單克隆抗體（以1∶1 000稀釋）100μl／孔，37℃1h后洗板；羊抗小鼠二抗（以1∶3 000稀釋）100μl／孔，37℃1h后洗板；鄰苯二胺－過氧化氫顯色系統(tǒng)顯色，置37℃避光顯色10 min后終止反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)A490值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05時(shí)視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UUO大鼠腎臟病理學(xué)檢查

免疫組化結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腎臟無明顯病理改變，Clusterin蛋白無顯著表達(dá)，免疫組化評(píng)分為0分；造模1天的大鼠可觀察到腎小管擴(kuò)張，偶見Clusterin有表達(dá)，評(píng)分為1分；造模3天后大鼠梗阻病變明顯，可見腎間質(zhì)纖維化，腎小管嚴(yán)重?fù)p傷，且Clusterin表達(dá)明顯增多，評(píng)分為3分；4組（造模7天）大鼠梗阻病變相比3組有所減輕，纖維組織增加，Clusterin表達(dá)有所減少，評(píng)分為2分。見圖1。

2.2 各組UUO大鼠尿液中Clusterin表達(dá)

經(jīng)檢測(cè)UUO造模成功第1－2d（0.54±0.16，0.63±0.20）尿液中Clusterin表達(dá)即開始升高，但與假手術(shù)組（0.49±0.18）相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明大鼠造模后1－2d尿液中Clusterin即開始表達(dá)，UUO造模后第3－5d尿液中Clusterin（0.70± 0.21、0.81±0.29、0.78±0.27）均較假手術(shù)組尿液表達(dá)明顯升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），UUO造模后第6－7d尿液中Clusterin含量開始有所下降，但仍維持在較高水平（0.74±0.23、0.67± 0.21）。結(jié)果表明大鼠UUO造模成功后1－2d尿液中Clusterin即開始出現(xiàn)，第3－5d開始含量明顯增加，且達(dá)到高峰，第6－7d開始Clusterin含量趨于下降，但仍高于正常水平。

圖1 假手術(shù)組及模型組大鼠腎臟Clusterin表達(dá)（免疫組化，×200）

3 討論

單側(cè)輸尿管梗阻（uniliteral ureteral obstruction，UUO）模型是被廣泛應(yīng)用的較好的腎小管間質(zhì)纖維化模型，腎功能的惡化很大程度上取決于腎小管間質(zhì)纖維化的程度，且腎小管間質(zhì)纖維化通常是多種病因所致的慢性腎臟疾病進(jìn)展甚至發(fā)展為終末期腎病的最后共同通路［3］。Clusterin是體內(nèi)一種異二聚體糖蛋白，最初被發(fā)現(xiàn)于公羊睪丸液，在正常腎組織中很難檢測(cè)到，但在一些疾病導(dǎo)致的腎損傷時(shí)，Clusterin可見表達(dá)且參與疾病進(jìn)程，如腎缺血再灌注損傷（IRI）發(fā)生時(shí)Clusterin即是一個(gè)保護(hù)細(xì)胞功能的分子伴侶蛋白［4］，有研究將腎小管上皮細(xì)胞做缺血再灌注誘導(dǎo)后第1d腎小管上皮細(xì)胞開始凋亡，且Clusterin開始表達(dá)，第3d時(shí)其表達(dá)至高峰，第7d時(shí)細(xì)胞功能基本恢復(fù)正常，但敲除Clusterin表達(dá)后腎小管上皮細(xì)胞凋亡的敏感性增強(qiáng)，提示Clusterin的表達(dá)缺乏可加重IRI損傷［5］。Marcella［6］等人采用2.5小時(shí)冷缺血的大鼠腎移植模型，研究發(fā)現(xiàn)在慢性腎移植腎病導(dǎo)致的腎損傷時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，腎間質(zhì)纖維化明顯，腎小管嚴(yán)重?cái)U(kuò)張，同時(shí)Clusterin表達(dá)上調(diào)且呈時(shí)間依賴性，其相比KIM－1和NGAL等分子標(biāo)志物具更高特異性和敏感性。

本實(shí)驗(yàn)通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎造成急性腎損傷模型，造模后梗阻側(cè)腎臟明顯腫大，腎皮質(zhì)變薄，組織病理顯示腎間質(zhì)淋巴單核細(xì)胞浸潤、腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)水腫嚴(yán)重，隨造模時(shí)間的延長，腎小管產(chǎn)生囊性擴(kuò)張、水腫程度減輕、纖維化病變加重，提示UUO造模成功。免疫組化檢測(cè)UUO大鼠腎臟Clusterin表達(dá)，結(jié)果表明：造模第1d時(shí)腎臟偶見Clusterin表達(dá)，第3d時(shí)表達(dá)最為明顯，第7d時(shí)Clusterin表達(dá)減少，但較假手術(shù)組比較腎損傷有所減輕。ELISA結(jié)果顯示第1dUUO大鼠尿液即有Clusterin表達(dá)，第3－5d尿液中Clusterin表達(dá)明顯增加且達(dá)到高峰，第6－7d開始尿液中其含量開始減少，但仍明顯高于正常水平。提示尿液Clusterin含量與其在UUO腎臟中含量及病變程度關(guān)聯(lián)性好，即UUO腎損傷早期尿液中Clusterin表達(dá)即有改變，提示尿液中Clusterin含量可作為UUO導(dǎo)致的腎損傷的生物標(biāo)志物，且具較好的敏感性。本研究為系列研究，在前期研究中我們已證實(shí)尿液Clusterin含量與慶大霉素所致大鼠腎損傷病變程度關(guān)相關(guān)性好，本次又在UUO腎損傷模型中進(jìn)行了驗(yàn)證，為Clusterin盡早應(yīng)用于臨床腎損傷的早期診斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Zhou W，Guan Q，Kwan CCH，et al.Loss of clusterin expression worsens renal ischemia－reperfusion injury［J］.American Journal of Physiology－Renal Physiology，2010，298（3）：F568.

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2013－11－20）

1007－4287（2014）10－1601－02

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（科技支撐計(jì)劃20120962）；吉林大學(xué)開放性創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（2013B73337）

＊通訊作者

文章編號(hào)：1007－4287（2014）10－1603－04