張 馨，張 昱

（1.吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）

β淀粉樣蛋白在血管性癡呆模型大鼠額葉中表達(dá)的研究

張 馨1，張 昱2

（1.吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林長春130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）

血管性癡呆（Vascular dementia，VD）是指因腦血管疾病所致的以記憶、認(rèn)知和行為等高級(jí)智能活動(dòng)明顯減退的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征。近年來一些研究表明，β淀粉樣蛋白（Aβ）不僅存在于Alzheimer病（AD）中，同樣在缺血性腦血管疾病中被發(fā)現(xiàn)［14］。本實(shí)驗(yàn)研究了血管性癡呆大鼠額葉中Aβ的表達(dá)，并闡述其在血管性癡呆發(fā)病中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備選用健康4－5個(gè)月Wistar大鼠80只，體重300－360g，購自吉林大學(xué)基礎(chǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。利用Morris水迷宮淘汰學(xué)習(xí)能力差的大鼠，入組大鼠術(shù)前記憶能力無顯著性差異，隨機(jī)分為假手術(shù)組和癡呆組（每組28只），每組按不同時(shí)間點(diǎn)又分為術(shù)后4周，8周，12周，16周組（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)7只）。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷法制備血管性癡呆模型，假手術(shù)組切口、分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，不結(jié)扎、不剪斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈。分別于術(shù)后4周，8周，12周，16周后經(jīng)Morris水迷宮記憶能力檢測(cè)證實(shí)癡呆模型成立。

1.2 免疫組織化學(xué)染色各組造模成功后經(jīng)左心室插管，用4%多聚甲醛固定液灌注，常規(guī)取腦，4℃條件下用4%多聚甲醛浸泡腦組織6h后，石蠟包埋，取額葉組織連續(xù)切片，免疫組化染色。Aβ1－42抗體、BACE抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：每只模型選擇額葉錐體細(xì)胞層10張連續(xù)切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野（40×10倍光鏡）計(jì)數(shù)，取5個(gè)視野的平均值，單位以“個(gè)／視野”表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果均以ˉx ±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

各組大鼠Aβ1－42、BACE在額葉的表達(dá)：①癡呆組大鼠在造模后4w－16w，額葉Aβ1－42陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多，明顯高于正常水平（P＜0.01），見表1；②BACE表達(dá)在額葉的陽性細(xì)胞數(shù)也逐漸增多，與假手術(shù)組相比有顯著差異（P＜0.01），見表2。

3 討論

研究證實(shí)包括動(dòng)脈硬化在內(nèi)的腦缺血均可引起腦內(nèi)Aβ表達(dá)增多，在腦動(dòng)脈硬化中，Aβ合成增多，不僅導(dǎo)致Aβ沉積在腦組織中形成老年斑，而且通過血管周圍途徑清除減少［1］。在對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎老年大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)由于神經(jīng)元內(nèi)淀粉樣前體蛋白（APP）向細(xì)胞外沉積，導(dǎo)致腦實(shí)質(zhì)中Aβ沉積逐漸增多［5］。研究表明IL－1、IFN－γ、IL－1β等炎性因子與Aβ生成關(guān)系密切，IFN－γ與TNFα或IL－1β聯(lián)合可能通過β－分泌酶分解的未成熟的APP分子誘導(dǎo)Aβ的產(chǎn)生［6］。Gervais等［7］研究顯示APP能被凋亡過程中的Caspase直接有效地剪切，在細(xì)胞興奮性毒性及急性缺血性腦損傷作用下，Caspase介導(dǎo)的蛋白水解作用占優(yōu)勢(shì)，Caspase－3是APP裂解的主要剪切酶，導(dǎo)致Aβ生成增多。病理?xiàng)l件下，由β－分泌酶（BACE）和γ－分泌酶共同作用于淀粉樣前體蛋白（APP）形成長度不等Aβ片段。腦缺血可導(dǎo)致β－分泌酶和γ－分泌酶表達(dá)增加，腦缺血后的氧化應(yīng)激反應(yīng)可誘導(dǎo)產(chǎn)生分泌酶，腦缺血促進(jìn)了Aβ過多產(chǎn)生和聚集，而Aβ對(duì)于缺血性神經(jīng)元細(xì)胞有毒性作用［8］。體外實(shí)驗(yàn)的大鼠腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（RBE4）中，低氧誘導(dǎo)BACE1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致Aβ產(chǎn)生明顯增多，從而認(rèn)為缺血性事件可能導(dǎo)致腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的淀粉樣蛋白代謝增強(qiáng)，導(dǎo)致Aβ42沉積［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠慢性缺血后額葉Aβ1－42表達(dá)較假手術(shù)組明顯增多，分析其機(jī)制可能是綜合性的，除了前面提到過的APP及BACE表達(dá)增加、炎性因子刺激、氧化應(yīng)激反應(yīng)、Caspase對(duì)APP的異常剪切外，還可能與腦內(nèi)Aβ的清除減少有關(guān)，而Aβ的清除減少可能與以下三方面有關(guān)①Aβ的細(xì)胞外降解減少；②細(xì)胞內(nèi)吞Aβ減少［10］；③血腦屏障被腦缺血所破壞，導(dǎo)致Aβ通過血腦屏障清除功能異常［11］。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠額葉Aβ1－42免疫陽性細(xì)胞數(shù)（ˉx±s，n＝7）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠額葉BACE免疫陽性細(xì)胞數(shù)（ˉx±s，n＝7）

通過本實(shí)驗(yàn)，我們推測(cè)Aβ生成增多可能與血管性癡呆模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力下降有關(guān)。腦內(nèi)Aβ增多可損害膽堿能系統(tǒng)，誘發(fā)炎性反應(yīng)，并導(dǎo)致突觸丟失、軸索損傷、神經(jīng)元凋亡［12］等，上述多種因素最終導(dǎo)致了學(xué)習(xí)記憶能力的障礙。

［1］Ihara M.Management of cerebral small vessel disease for the diagnosis and treatment of dementia［J］.Brain Nerve，2013，65（7）：801.

［2］Shi J，Yang SH，Stubley L，et al.Hypoperfusion induces overexpression ofβ－amyloid precursor protein mRNA in a focal ischemic rodent model［J］.Brain Res，2000，853（1）：1.

［3］Wen Y，Onyewuchi O，Yang S，et al.Increased beta－secretase activity and expression in rats following transient cerebral ischemia［J］.Brain Res，2004，1009（1－2）：1.

［4］Nihashi T，Inao S，Katita Y，et al.Expression and distribution ofβ amyloid precursor protein andβamyloid peptide in reactive astrocytes after transient middle cerebral artery occlusion［J］.Acta Neurochir（Wien），2001，143（3）：287.

［5］Bennett SA，Pappas BA，Stevens WD，et al.Cleavage of amyloid precursor protein elicited by chronic cerebral hypoperfusion［J］.Neurobiol Aging，2000，21（2）：207.

［6］Blasko I，Veerhuis R，Stampfer－Kountchev M，et al.Costimulatory effects of Inte－rfereon－gamma and interleukin－1beta or tumor necrosis factor alpha on the synthesis of Abeta1－40and Abeta1－42 by human astecytes［J］.Neurobiol Dis，2000，7（6PtB）：682.

［7］Gervais FG，Xu D，Robertson GS，et al.Involvement of caspases in proteolytic cleavage of Alzheimer’s amyloid－beta precursor protein and amyloidogenic A beta peptide formation［J］.Cell，1999，93（7）：395.

［8］Pluta R，F(xiàn)urmaga－Jabナońska W，Maciejewski R，et al.Brain ischemia activatesβ－andγ－secretase cleavage of amyloid precursor protein：significance in sporadic Alzheimer＇s disease［J］.Mol Neurobiol，2013，47（1）：425.

［9］Bulbarelli A，Lonati E，Brambilla A，et al.Aβ42production in brain capillary endothelial cells after oxygen and glucose deprivation［J］.Mol Cell Neurosci，2012，49（4）：415.

［10］鄭 瑩，閆福嶺.腦缺血對(duì)腦內(nèi)β－淀粉樣蛋白清除的影響［J］.中國腦血管病雜志，2007，4（4）：186.

［11］lokovic BV.Neurovascular mechanisms of Alzheimer’s neurodegeneration［J］.Trends Neurosci，2005，28（4）：202.

［12］Abad MA，Enguita M，DeGregorio－Rocasolano N，et al.Neuronal pentraxin 1contributes to the neuronal damage evoked by amyloid－beta and is overexpressed in dystrophic neurites in Alzheimer＇s brain［J］.J Neurosci，2006，26（49）：12735.

張馨（1978－），女，博士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病及老年期癡呆研究。

2013－10－17）

1007－4287（2014）10－1570－02