汪志榮等

摘要

[目的]研究石油降解固體菌肥的制備和應(yīng)用。[方法]以從大港石油污染土壤篩選的石油降解細(xì)菌菌群為基礎(chǔ)，將液體石油降解菌劑接種到麩皮和鋸末質(zhì)量比為1∶1的固體介質(zhì)中培養(yǎng)，通過(guò)溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)固體菌肥影響，制備一種活菌數(shù)量較高的石油降解固體菌肥，將其應(yīng)用于不同含鹽量的石油污染土壤研究其修復(fù)效果。[結(jié)果]通過(guò)分析不同溫度、接種量對(duì)固體菌肥的特性的影響確定其短期內(nèi)的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃、接種量為15%、培養(yǎng)3 d，獲得固體菌肥的活菌量可達(dá)1.95×1010 cfu/ml；將石油降解固體菌肥進(jìn)行60 d石油污染土壤修復(fù)表明，在含鹽量為2.0、6.1 g/kg的2種土壤中，60 d修復(fù)期結(jié)束后，石油降解率分別達(dá)52.91%、34.74%。[結(jié)論]該固體菌肥適宜用于輕度鹽土的石油污染土壤，并取得較好的降解效果。

關(guān)鍵詞固體菌肥；石油降解率；制備；應(yīng)用

中圖分類號(hào)S181.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）06-01810-03

Abstract [Objective] The research aimed to study the preparation and application of the petroleumdegrading solid fertilizer. [Method]Take the oildegrading bacterial community which screening petroleumcontaminated soil in Dagang as the foundation，the petroleumdegrading bacteria were inoculated into the solid medium containing the bran and the sawdust（the mass ratio of 1∶1），by temperature， inoculation amount and incubation time effect on solid fertilizer， preparing a higher number of active bacterium oildegrading solid fertilizer， applied to different amounts of petroleumcontaminated soil salinity to study its restorative effects. [Result]By analyzing the different temperature and inoculation amount of the characteristics of the solid fertilizer to determine the optimal culture conditions for its shortterm： culture temperature 37 ℃， inoculation amount 15%， cultured 3 d. The amount of active bacteria can reach 1.95×1010 cfu/ml. The solid fertilizer was used for remediation of crude oil contaminated soil， the experimental results show that under different salinity conditions， the petroleumdegrading rate in crude oil contaminated can respectively reach 52.91%、34.74% after two months of remediation. [Conclusion] The solid fertilizer is suitable for the low salt of petroleumcontaminated soil， and the effect of degradation is very well.

Key words Solid fertilizer； Petroleumdegrading rate；Preparation； Application

隨著石油使用量的不斷增加，在石油生產(chǎn)、貯運(yùn)、加工及使用過(guò)程中，由于井噴、泄漏、檢修等原因?qū)е率蜔N類的溢出和排放，造成土壤石油污染[1]，給油田及周圍帶來(lái)了嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題。而微生物修復(fù)具有不破壞植物生長(zhǎng)的土壤環(huán)境；對(duì)污染物能夠降解完全，并將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為無(wú)害的CO2和H2O，避免二次污染；處理形式多樣；成本明顯低于物理和化學(xué)法處理等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越受到人們的重視[2-5]。由于液體石油降解菌群在保存、運(yùn)輸和活性保存等方面存在諸多問(wèn)題，因此，將微生物固定在載體上以獲得高效、易于保存的固體菌肥是生物修復(fù)的一個(gè)很有前景的方向。

目前，關(guān)于石油污染土壤修復(fù)的研究大部分集中在石油降解菌株的篩選、石油降解機(jī)理以及土壤修復(fù)工藝方面，這些研究逐步證實(shí)了石油污染土壤微生物修復(fù)的可行性，但石油降解固體菌肥的研究較少。向石油污染土壤中投加高效生物菌肥是一種切實(shí)可行的原位修復(fù)技術(shù)，該技術(shù)在國(guó)外起步較早，已開(kāi)發(fā)出多種商品生物菌劑[6]，并應(yīng)用于實(shí)際的修復(fù)工程中，取得良好的修復(fù)效果[7-8]。

在我國(guó)研究較多的微生物菌肥主要涉及根瘤菌肥料、固氮菌肥料、磷細(xì)菌肥料，并制定了微生物肥料的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9]。關(guān)于石油污染土壤修復(fù)的石油降解固體菌肥的相關(guān)報(bào)道較少，在我國(guó)處于研發(fā)階段，但研究表明修復(fù)效果較好。胥九兵等將2種石油降解細(xì)菌菌劑接種到草炭和麩皮的固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制備BC-E和BC-I 2種菌劑，并采用研制的菌劑對(duì)石油污染土壤進(jìn)行修復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果表明1個(gè)月污染土壤中的石油降解率可達(dá)45%[10]。于勇勇等將菌液、油砂、鋸末和發(fā)酵后的農(nóng)家肥混合，進(jìn)行降解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)56 d的處理，菌劑強(qiáng)化處理單元最終油去除率達(dá)47.4%[11]。筆者以從大港石油污染土壤篩選的石油降解細(xì)菌菌群為基礎(chǔ)，選擇麩皮和鋸末作為固態(tài)培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)源和載體，通過(guò)溫度、接種量、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)固體菌肥影響，制備一種活菌數(shù)量較高的石油降解固體菌肥，將其應(yīng)用于不同含鹽量的石油污染土壤研究其修復(fù)效果，以期為現(xiàn)場(chǎng)石油污染鹽堿土壤微生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

試驗(yàn)選材。試驗(yàn)用土壤取自天津理工大學(xué)校園土，加入原油配置成石油濃度為5 500 mg/kg的石油污染土壤。液體菌劑為高效石油降解細(xì)菌菌群，菌群經(jīng)該實(shí)驗(yàn)室通過(guò)采自天津大港油田石油污染土壤，篩選馴化后獲得[12]。麩皮是優(yōu)良的固態(tài)發(fā)酵的天然原料，含有易于微生物利用的豐富的碳氮源；鋸末持水力強(qiáng)，通透性好，有利于氧的傳輸，為微生物的生長(zhǎng)提供有利的降解條件，同時(shí)也是良好的土壤改良劑，因此選擇麩皮和鋸末為菌肥的固體介質(zhì)。

1.1.2

培養(yǎng)基的選擇。試驗(yàn)過(guò)程中使用的液體LB培養(yǎng)基為蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 ml、pH 7.0，固體LB培養(yǎng)基為蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 ml、pH 7.0、瓊脂18 g。

1.2石油降解固體菌肥的制備方法

將保存的高效石油降解菌群活化，以滅菌的麩皮、鋸末為固體介質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)研究不同接種量、溫度、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)固體菌肥特性的影響確定最優(yōu)培養(yǎng)條件，以此制備固體菌肥，為生產(chǎn)實(shí)踐奠定基礎(chǔ)。將石油降解菌群按10%、15%、30%的接種量分別接入滅菌的固體介質(zhì)（麩皮和鋸末質(zhì)量比為1∶1）中，維持60%含水率，分別在室溫（春末夏初11～16 ℃）下、37 ℃下培養(yǎng)并測(cè)其在培養(yǎng)過(guò)程中的pH和細(xì)菌數(shù)量。

2.1.1

固體菌肥培養(yǎng)過(guò)程中pH的變化。從圖1可以看出，對(duì)于室溫、37 ℃，在接種量10%、15%、30%的條件下，pH呈現(xiàn)相似的規(guī)律，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加pH不斷上升；在7 d的培養(yǎng)過(guò)程中，在2種溫度下，3個(gè)接種量的（接種量由低到高）pH變化幅度均不大，室溫下分別是0.45、0.14、0.12，37 ℃下分別是0.39、0.44、0.44。2種溫度下，固體菌肥中pH均升高，造成pH升高的原因可能是由于微生物生長(zhǎng)需要適宜的酸堿環(huán)境，在利用固體介質(zhì)和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)程中，產(chǎn)生一些物質(zhì)導(dǎo)致了菌液中pH的升高，以此營(yíng)造有利的生長(zhǎng)環(huán)境；pH變化幅度不大，主要原因可能是固體介質(zhì)本身具有緩沖能力，使其在微生物適宜生長(zhǎng)的pH范圍內(nèi)波動(dòng)?？梢猿醪脚袛嘣谡麄€(gè)固體菌肥培養(yǎng)過(guò)程中，溫度、接種量對(duì)菌液中pH具有一定的影響。

2.1.2

固體菌肥培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)菌數(shù)量的變化。從圖2可以看出，在不同培養(yǎng)溫度（室溫和37 ℃）和不同接種量的大小情況下，固體菌肥中的微生物數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)出現(xiàn)相似的規(guī)律，即在0～7 d微生物數(shù)量呈現(xiàn)迅速上升并逐漸達(dá)到穩(wěn)定的趨勢(shì)，均可達(dá)109 cfu/ml；細(xì)菌在3個(gè)接種量下，均有較為理想的長(zhǎng)勢(shì)，培養(yǎng)到1 d時(shí)微生物在數(shù)量級(jí)上均保持在109 cfu/ml，這在一定程度上說(shuō)明將微生物接入到固體介質(zhì)中，微生物能夠較快適應(yīng)該體系，并開(kāi)始利用其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供自身生長(zhǎng)。

2.1.2.1

不同培養(yǎng)溫度下。從不同培養(yǎng)溫度對(duì)比上看，在3種接種量（分別為10%、15%、30%）下，在7 d培養(yǎng)過(guò)程中，37 ℃培養(yǎng)下的微生物數(shù)量均比室溫下的高，說(shuō)明37 ℃較室溫更適宜微生物的生長(zhǎng)；在2種溫度下，0～3 d內(nèi)微生物數(shù)量上升均很快，這在一定程度上說(shuō)明將微生物接入到固體介質(zhì)中，微生物能夠較快適應(yīng)該體系，并開(kāi)始利用其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供自身生長(zhǎng)。在室溫培養(yǎng)，3種接種量條件下，在0～3 d微生物數(shù)量快速增加，3～7 d趨向平衡，7 d后均達(dá)109 cfu/ml；在37 ℃培養(yǎng)，3種接種量條件下，在0～3 d微生物數(shù)量快速增加達(dá)到最大值，均達(dá)1010cfu/ml，3～7 d有下降的趨勢(shì)。造成這一現(xiàn)象的主要原因是初期微生物能夠較快適應(yīng)固體介質(zhì)環(huán)境，利用其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供自身生長(zhǎng)進(jìn)行大量的繁殖；在3～7 d時(shí)，可能是固體介質(zhì)和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足大量繁殖的微生物生長(zhǎng)，微生物開(kāi)始出現(xiàn)死亡呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

2.2石油降解固體菌肥的石油污染土壤修復(fù)應(yīng)用研究

將石油降解固體菌肥應(yīng)用于石油污染鹽堿土壤中，研究其修復(fù)能力。將固體菌肥以10%的接種量添加到不同含鹽量的石油污染土壤中，根據(jù)鹽漬化土壤的劃分標(biāo)準(zhǔn)[15]，石油污染土壤的含鹽量設(shè)計(jì)為輕度鹽土2.0 g/kg、重度鹽土6.1 g/kg，進(jìn)行60 d的生物修復(fù)，測(cè)得各時(shí)期土壤石油含量、細(xì)菌數(shù)量、含鹽量、pH。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2014年

2.2.1

土壤中石油降解率。從圖3可以看出，在不加菌肥的土壤（作為空白對(duì)比）中，石油在土著微生物作用下逐步降解，60 d的修復(fù)期結(jié)束后，含鹽量為2.0、6.1 g/kg的2種土壤中石油降解率分別達(dá)11.27%、8.09%。添加固體菌肥后，在2種鹽分條件下，隨著時(shí)間的增加，土壤中石油降解率在不斷的增加；在0～35 d內(nèi)，石油降解率變化幅度較大，在35～60 d內(nèi)石油降解率趨向平穩(wěn)；在低鹽條件下的石油降解率高于高鹽條件，在15 d時(shí)，2種含鹽量下的石油降解率分別為23.09%、11.58%，說(shuō)明在短期內(nèi)微生物對(duì)石油有一定程度的降解效果；在第35天時(shí)，2種鹽分的土壤中石油降解率分別達(dá)4600%、28.13%；50 d時(shí)，石油降解率變化幅度開(kāi)始變小，石油降解率分別達(dá)50.36%、32.90%，低鹽條件下的石油降解率比高鹽條件下高17.46%；60 d修復(fù)期結(jié)束后，石油降解率分別達(dá)52.91%、34.74%。

3結(jié)論

（1）通過(guò)將液體石油降解菌劑接種到麩皮和鋸末質(zhì)量比為1∶1的固體介質(zhì)中培養(yǎng)，以此來(lái)制備石油降解固體菌肥。通過(guò)分析不同溫度（室溫、37 ℃恒溫）、接種量（10%、15%、30%）對(duì)固體菌肥的特性的影響，確定其短期內(nèi)的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度37 ℃、接種量為15%、培養(yǎng)3 d，獲得固體

（2）將石油降解固體菌肥應(yīng)用于不同含鹽量的石油污染土壤中，對(duì)其進(jìn)行了60 d的生物修復(fù)，結(jié)果表明，在含鹽量為2.0、6.1 g/kg的2種土壤中，60 d修復(fù)期結(jié)束后，固體菌肥對(duì)石油的降解率分別達(dá)52.91%、34.74%，該固體菌肥適于輕度鹽堿石油污染土壤；其修復(fù)效果明顯優(yōu)于自然降解，固體菌肥發(fā)揮了顯著作用。

（3）固體菌肥的應(yīng)用受外界因素影響較大，溫度、土壤濕度、鹽堿性、空氣的流通性的差異均會(huì)不同程度地影響到固體菌肥對(duì)石油的降解能力。因此，在未來(lái)的實(shí)際應(yīng)用時(shí)還需要考慮固體菌肥的的最佳使用方法、條件，使固體菌肥發(fā)揮最大效力。

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