韓旭洋　馬玲　李玉文等

摘要 [目的] 探討離子液體對斜紋夜蛾體內(nèi)解毒酶活性的影響。[方法] 采用點(diǎn)滴法測定1甲基咪唑、溴化1丙基3甲基咪唑、溴化1辛基3甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾4齡幼蟲的急性毒性，并測定不同觸殺時間后幼蟲體內(nèi)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）的活性。[結(jié)果] 1甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾體內(nèi)GSTs活性的影響從經(jīng)過LC20濃度處理來看呈始終抑制的趨勢，從經(jīng)過LC50濃度處理來看呈先誘導(dǎo)后抑制的趨勢。1甲基咪唑（LC20和LC50）處理的斜紋夜蛾體內(nèi)CarE活性均呈始終抑制的趨勢。溴化1丙基3甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾體內(nèi)GSTs活性的影響從經(jīng)過LC20濃度處理來看呈先誘導(dǎo)后抑制的趨勢，從經(jīng)過LC50濃度處理來看呈始終抑制的趨勢。溴化1丙基3甲基咪唑（LC20和LC50）處理的斜紋夜蛾體內(nèi)CarE活性均呈始終抑制的趨勢。溴化1辛基3甲基咪唑（LC20和LC50）處理的斜紋夜蛾體內(nèi)GSTs活性均呈先誘導(dǎo)后抑制的趨勢。溴化1辛基3甲基咪唑（LC20和LC50）處理的斜紋夜蛾體內(nèi)CarE活性均呈始終抑制的趨勢。[結(jié)論]3種離子液體在斜紋夜蛾體內(nèi)積累顯著影響斜紋夜蛾體內(nèi) GSTs和 CarE的活性，減弱斜紋夜蛾體內(nèi)代謝、分解農(nóng)藥的能力，從而對其產(chǎn)生毒害作用。

關(guān)鍵詞 離子液體；斜紋夜蛾；急性毒性；解毒酶

中圖分類號 S433.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）08-02347-03

Effects of Ionic Liquids on Detoxifying Enzymes Activities of Prodenia litura

HAN Xuyang， LU Man et al

（Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； Harbin Normal University， Harbin， Heilongjiang 150026）

Abstract [Objective] To investigate effects of ionic liquids on detoxifying enzymes activities of Prodenia litura. [Method] 1Methylimidazole， 1propyl3methylimidazolium Bromide， 1Octyl3methylimidazolium Bromide were used to test the acute toxicity of 4th instar larvae of Prodenia litura by topical， and investigate the activities of glutathione Stransfer（GSTs）， carboxylesterase （CarE） in the larvae at different tag time. [Result] Effect of 1Methylimidazole GSTs in vivo activity of Spodoptera through LC20 concentrations from the point of view was always suppressed trend from view after LC50 concentrations after the first trend was induced inhibition. 1 methylimidazole （LC20 and LC50） CarE cutworm activity in vivo treatment always showed inhibition trend. 1propyl3methylimidazolium Bromide Spodoptera GSTs activity in vivo through LC20 concentrations from the point of view was suppressed after the first induction trend is always suppressed through LC50 concentrations from the point of view presented. 1propyl3methylimidazolium Bromide （LC20 and LC50） Spodoptera CarE activity in vivo treatment always showed inhibition trend. 1Octyl3methylimidazolium Bromide （LC20 and LC50） Spodoptera GSTs activity in vivo showed after the first treatment induced inhibition of trend. 1Octyl3methylimidazolium Bromide （LC20 and LC50） Spodoptera CarE activity in vivo treatment always showed inhibition trend. [Conclusion] Three ionic liquids were accumulated in the body significantly affect the GSTs and CarE activities in Spodoptera litura， diminished capacity Spodoptera metabolism， decomposition of pesticides， and thus produce its toxic effects.

Key words Ionic liquids； Prodenia litura； Acute toxicity； Detoxifying enzymes

斜紋夜蛾P(guān)rodenia litura屬鱗翅目夜蛾科，又名蓮紋夜蛾，俗稱夜盜蟲、烏頭蟲等。除青海、新疆未明外，我國其他各?。ㄗ灾螀^(qū)）都有發(fā)生。因斜紋夜蛾容易飼養(yǎng)且發(fā)生世代多[7]，抗氧化強(qiáng)，因此，在生物學(xué)、分類學(xué)、酶學(xué)以及環(huán)境學(xué)等方面的研究中通常都會用其作為昆蟲試驗(yàn)的材料[1-6]。

離子液體（Ionic liquids）是在室溫下為液體的離子化合物，近幾年來已被開發(fā)成一種新型綠色化學(xué)反應(yīng)介質(zhì)[8-9]。目前，國內(nèi)外對離子液體的研究主要集中在合成、物化性質(zhì)等領(lǐng)域[10-11]。由于離子液體的研究還處于起步階段，關(guān)于其毒性方面的報道很少[12-13]。所以筆者選取3種有代表性的離子液體對斜紋夜蛾進(jìn)行毒性試驗(yàn)，進(jìn)一步明確其殺蟲活性和作用機(jī)理。昆蟲體內(nèi)的解毒酶是在農(nóng)藥長期施用下，體內(nèi)產(chǎn)生的一種能夠代謝農(nóng)藥的一類酶[14]，就3種離子液體對斜紋夜蛾體內(nèi)GSTs和CarE這2種解毒酶活性的影響進(jìn)行了首次探討，旨在初步探究離子液體對昆蟲的殺蟲機(jī)理，為開發(fā)綠色、高效、安全的新型殺蟲劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

斜紋夜蛾和飼料均購于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)。斜紋夜蛾置于溫度（28±2）℃、相對濕度65%、光周期12L∶12D的生化培養(yǎng)箱中，用飼料喂養(yǎng)，馴化15 d后挑選健壯、顏色、大小一致的斜紋夜蛾4齡幼蟲用于試驗(yàn)。

1.2 主要試劑

1甲基咪唑、溴化1丙基3甲基咪唑、溴化1辛基3甲基咪唑，均購于上海江萊生物科技有限公司；牛血清白蛋白（ BSA）、乙二胺四乙酸（ EDTA）、二硫蘇糖醇（DTT）、對硝基苯酚磷酸二鈉（PNPP）均購于Amresco 公司；1氯2，4二硝基苯（CDNB）、固藍(lán)B鹽（Fast blue B salt）、考馬斯亮藍(lán) G250購自哈爾濱益世達(dá)公司。

1.3 離子液體對斜紋夜蛾4齡幼蟲的急性毒性測定 采用點(diǎn)滴法[15]觸殺斜紋夜蛾4齡幼蟲，進(jìn)行毒性測定，用丙酮將離子液體溶解成藥液。預(yù)試驗(yàn)：大范圍設(shè)定一系列濃度梯度，每個濃度為1個試驗(yàn)組，每個試驗(yàn)組設(shè)置 2 個平行試驗(yàn)，挑選健康、大小、顏色一致的4齡斜紋夜蛾幼蟲 10頭放入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪一層飼料。將10 μl藥液滴于幼蟲的前胸背板處，用丙酮進(jìn)行對照，48 h后觀察幼蟲死亡數(shù)，確定幼蟲100%致死濃度和零致死濃度。正式試驗(yàn)：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定的濃度范圍，將藥液按照幾何級數(shù)形式稀釋成5個濃度梯度，每個濃度為1個試驗(yàn)組，每個試驗(yàn)組設(shè)置 3 個平行試驗(yàn)，挑選健康、大小、顏色一致的4齡斜紋夜蛾幼蟲 10頭放入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪一層飼料。將10 μl的藥液滴于幼蟲的前胸背板處，用丙酮進(jìn)行對照，觀察斜紋夜蛾的中毒情況并及時挑出死亡個體，分別于觸殺處理的12、24、36和48 h后統(tǒng)計死亡數(shù)。以鑷子輕觸試蟲，對刺激無反應(yīng)者視為死亡。

1.4 用于測定酶活性的試蟲處理

處理方法同“1.3”。根據(jù)3種離子液體對斜紋夜蛾4齡幼蟲的毒力測定結(jié)果，以48 h的LC50為基準(zhǔn)，選取丙酮液（ 丙酮∶蒸餾水=2∶1，V/V）配制成母液，之后再用蒸餾水稀釋成亞致死濃度 LC20，以相同溶劑作為對照組。將健康、大小、顏色一致的4齡斜紋夜蛾幼蟲 16頭放入培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部鋪一層飼料。將10 μl的藥液滴于幼蟲的前胸背板處，用丙酮進(jìn)行對照，處理12、24、36和48 h后取樣，儲存于-20 ℃冰箱用于制備酶液。

1.5 酶液制備

從每個處理組均隨機(jī)選取2頭斜紋夜蛾幼蟲加1 ml預(yù)冷過的提取液，置于冰浴過的玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿，GSTs和CarE在4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，上層清液即為酶液。

1.6 酶活性的測定

蛋白質(zhì)含量測定參照 Bradford（ 1976）的考馬斯亮藍(lán) G250法。

GSTs活性測定參照Booth 等（1961）方法，略有改進(jìn)。在測定試管中分別加入2.3 ml 0.1 mol/L PBS（pH6.5），0.5 ml 9 mmol/L還原型谷胱甘肽（GSH）和0.02 ml酶液，0.1 ml 45 mol/L的CDNB，利用紫外分光光度計在340 nm波長下，測定OD值，每0.5 min觀測一次，共觀察3 min。

CarE活性測定參照Van Asperen（ 1962）方法，略有改進(jìn)。取0.005 ml酶液與1.8 ml αNA混合均勻，置于30 ℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，加入0.9 ml顯色劑終止反應(yīng)，在600 nm波長下測定OD值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用 POLO軟件計算3種離子液體對斜紋夜蛾4齡幼蟲的致死中濃度（ LC50）和亞致死濃度（ LC20）以及95%置信區(qū)間。 采用SPSS18.0 軟件進(jìn)行顯著性分析（P=0.05），采用Eccel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種離子液體對斜紋夜蛾4齡幼蟲的急性毒性

從表1可以看出，1甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾幼蟲 12、24、36和48 h的 LC50分別為32.035、20.383、12.625、7.671 mg/L，LC20分別為16.668、10.145、6.280、4.448 mg/L。從表2可以看出，溴化1丙基3甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾幼蟲 12、24、36和48 h的LC50分別為46.546、21.398、11.729、7.406 mg/L，LC20分別為21.682、7.771、4.544、3.973 mg/L。從表3可以看出，溴化1辛基3甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾幼蟲12、24、36和48 h的LC50分別為61.111、25.243、14.142、9.726 mg/L，LC20分別為20.177、9.510、6.383、5.297 mg/L。

2.2 3種離子液體對斜紋夜蛾體內(nèi)解毒酶活性的影響

選擇3種離子液體1甲基咪唑48 h的LC50（7.671 mg/L）和48 h的LC20（4.448 mg/L），溴化1丙基3甲基咪唑48 h的LC50（7.406 mg/L）和48 h的LC20（3.973 mg/L），溴化1辛基3甲基咪唑48 h的LC50（9.726 mg/L）和48 h的LC20（5.297 mg/L），作為處理濃度，測定3種離子液體對斜紋夜蛾體內(nèi)解毒酶活性的影響。

2.2.1 1甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾體內(nèi)GSTs、CarE活性的影響。

從圖1可以看出，經(jīng)過LC20濃度處理，斜紋夜蛾體內(nèi)GSTs活性均低于對照組。12 h后，抑制作用不顯著。24、36、48 h后，有顯著的抑制作用（P<0.05）。經(jīng)過LC50濃度處理，12 h后酶活性高于對照組，誘導(dǎo)作用顯著（P<0.05）。24、36、48 h后酶活性均低于對照組，且抑制作用顯著（P<0.05）。1甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾體內(nèi)GSTs活性的影響從經(jīng)過LC20濃度處理來看呈始終抑制的趨勢，從經(jīng)過LC50濃度處理來看呈先誘導(dǎo)后抑制的趨勢。

2.2.2 溴化1丙基3甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾體內(nèi)GSTs、CarE活性的影響。

從圖3可以看出，經(jīng)過LC20濃度處理，12 h后斜紋夜蛾體內(nèi)GSTs活性高于對照組，誘導(dǎo)作用顯著（P<0.05）。24、36、48 h后酶活性均低于對照組，抑制作用顯著（P<0.05）。經(jīng)過LC50濃度處理，酶活性均低于對照組，抑制作用顯著（P<0.05）。溴化1丙基3甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾體內(nèi)GSTs活性的影響從經(jīng)過LC20濃度處理來看呈先誘導(dǎo)后抑制的趨勢，從經(jīng)過LC50濃度處理來看呈始終抑制的趨勢。

2.2.3 溴化1辛基3甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾體內(nèi)GSTs、CarE活性的影響。

從圖5可以看出，經(jīng)過LC20濃度處理，12 h后斜紋夜蛾體內(nèi)GSTs活性高于對照組，誘導(dǎo)作用不顯著。24、36、48 h后酶活性均低于對照組，24和36 h有顯著抑制作用（P<0.05），48 h抑制作用不顯著。經(jīng)過LC50濃度處理，12 h后酶活性高于對照組，誘導(dǎo)作用不顯著。24、36、48 h后酶活性均低于對照組，有顯著抑制作用（P<0.05）。溴化1辛基3甲基咪唑?qū)π奔y夜蛾體內(nèi)GSTs活性的影響從經(jīng)過LC20濃度處理來看呈先誘導(dǎo)后抑制的趨勢，從經(jīng)過LC50濃度處理來看呈先誘導(dǎo)后抑制的趨勢。

3 結(jié)論與討論

3種離子液體在對斜紋夜蛾進(jìn)行觸殺試驗(yàn)時，試蟲接入培養(yǎng)皿初期均表現(xiàn)出不同程度的興奮癥狀，隨著處理時間的延長，處理組幼蟲有的蟲體表現(xiàn)出抽搐、痙攣，并伴有吐水的癥狀，蟲體失水變軟，身體萎縮，最后死亡或出現(xiàn)中毒癥狀。隨著3種離子液體作用時間的延長，LC50值均逐漸降低，表明隨處理時間的延長，3種離子液體對斜紋夜蛾幼蟲的毒性逐漸增加。該試驗(yàn)表明，3種離子液體對斜紋夜蛾體內(nèi)GSTs、CarE的酶活性均有不同程度的影響。