尹魁林　 張瓊　 孫承燁

摘要 [目的]研究沾化冬棗離體培養(yǎng)的快速繁殖方法。[方法]以沾化冬棗莖尖為材料，以MS基本培養(yǎng)基，添加不同濃度IAA和6BA進(jìn)行離體培養(yǎng)及再生體系研究，優(yōu)選最佳培養(yǎng)條件。[結(jié)果]外植體最適取材時(shí)間為4月下旬，接種培養(yǎng)基為MS+2.5 mg/L GA3；最適增殖培養(yǎng)基為：頂芽切段繁殖MS+0.5 mg/L 6BA+0.25 mg/L IAA，芽叢分割繁殖MS+0.5 mg/L IBA+2 mg/L ZT；最適生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA；試管苗移栽的最適基質(zhì)為蛭石加草炭（1∶1，V/V），成活率可達(dá)78.8%。[結(jié)論]該方法優(yōu)選了沾化冬棗離體培養(yǎng)的快速繁殖方法，為沾化冬棗的種質(zhì)資源研究提供了可靠依據(jù)。

關(guān)鍵詞 沾化冬棗（Ziziphus jujuba Mill）；莖尖；組織培養(yǎng)；離體快繁

中圖分類號(hào) S665.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02269-02

Study on Rapid Propagation Technology of Zhanhua Brumal Jujube Stem Tip Culture

YIN Kuilin et al （Winter Jujube Institute of Zhanhua County， Binzhou， Shandong 256803）

Abstract [Objective] In order to explore the method for rapid propagation of Ziziphus jujuba Mill in vitro. [Method] With stem apex of Z. jujuba as material， MS as basic culture medium added with IAA， 6BA for in vitro culture， the regeneration system was studied. [Result] The most suitable time for explants is in late April， inoculation medium is MS+GA32.5 mg/L； the most suitable medium for bud proliferation： Cutting propagation of the terminal bud is MS+0.5 mg/L 6BA+0.25 mg/L IAA，bud segmentation propagation is MS+IBA 0.5 mg/L+ZT 2 mg/L； the most suitable medium for rooting is 1/2 MS+1 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA；The optimum matrix of plantlets is the vermiculite and peat （1∶1， V/V）， the survival rate can up to 78.8%.

Key words Ziziphus jujuba Mill； Stem tip； Tissue culture； Rapid propagation in vitro

沾化冬棗（Ziziphus jujuba Mill）是我國(guó)棗樹(shù)資源中稀有名貴的鮮食品種，以無(wú)與倫比的口感品質(zhì)，在全國(guó)具有較高的知名度和影響力[1]。近年來(lái)，隨著全國(guó)對(duì)沾化冬棗引種栽培和推廣工作的進(jìn)行，生產(chǎn)上對(duì)優(yōu)質(zhì)沾化冬棗苗的需求量急劇增加，利用莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)是取得大量無(wú)病毒優(yōu)質(zhì)苗木的一種有效方法[2-4]。為此，筆者對(duì)沾化冬棗莖尖培養(yǎng)快繁過(guò)程中的誘導(dǎo)分化、增殖、生根、移栽等技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行研究，以期為沾化冬棗的種質(zhì)資源研究提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試品種為沾化冬棗，經(jīng)鑒定為Ziziphus jujuba Mill；外植體為棗頭頂端主芽（莖尖）。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌培養(yǎng)苗的建立。于4月下旬～5月上旬，在沾化冬棗春季芽剛開(kāi)始萌發(fā)時(shí)，選取無(wú)病蟲(chóng)害的優(yōu)良單株上生長(zhǎng)旺盛的頂芽（即莖尖），將其莖尖剝?nèi)ネ獠堪ūＡ艏s1 cm）放入消毒瓶中，先用70%酒精漂洗30 s，然后用剛配好的5%次氯酸鈉溶液消毒4～8 min，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒3～5 min，消毒過(guò)后再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗4～5次，而后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在暗培養(yǎng)3～5 d后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，待7～14 d開(kāi)始變綠和生長(zhǎng)后，就可轉(zhuǎn)移到試管苗增殖培養(yǎng)基中。隨后通過(guò)切段繁殖或芽叢分割繁殖方法，經(jīng)過(guò)4～6代增殖培養(yǎng)，即可形成一定數(shù)量的試管苗，將高約1.5 cm以上的健壯嫩苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，約7 d即可看到根原基分化出來(lái)，20 d左右可長(zhǎng)出3～5條1.5～2.5 cm的細(xì)白主根和側(cè)根。

1.2.2 培養(yǎng)條件。基本培養(yǎng)基為MS；瓊脂5.10～5.25 g/L；蔗糖20～30 g/L；pH值6.2～6.4；光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx；光照時(shí)間為16 h/d；培養(yǎng)溫度20～25 ℃；空氣相對(duì)濕度40%～70%。

1.2.3 試管苗移栽。當(dāng)試管苗長(zhǎng)到3～5片葉，并生有2～5條長(zhǎng)1 cm以上白根時(shí)，即可進(jìn)行光培煉苗。將生根瓶移入溫室中3～5 d，增加光照強(qiáng)度，而后打開(kāi)瓶蓋通風(fēng)、透氣，煉苗2～3 d后，從瓶中取出幼苗，用溫水將附著在根上的培養(yǎng)基洗凈，然后移栽入裝有基質(zhì)的廣口花盆中，加蓋玻璃板并遮光或直接放在有遮陽(yáng)網(wǎng)的小拱棚中，開(kāi)始幾天保持空氣相對(duì)濕度90%以上，溫度控制在18～25 ℃，7 d后增加通氣。為了促進(jìn)生長(zhǎng)，其間澆2～3次1/10的MS培養(yǎng)液。待小苗過(guò)渡生長(zhǎng)1個(gè)月左右，即可形成完整的根系，并伴隨長(zhǎng)出4～5片新葉，則將苗移入田間苗圃中。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的誘導(dǎo)發(fā)芽 試驗(yàn)結(jié)果表明，沾化冬棗在無(wú)激素培養(yǎng)基上（即MS不加激素）能夠很好地分化，成活率較高，為78.9%。如果MS培養(yǎng)基中附加2.5 mg/L的GA3，則分化更好些，成活率為82%。一般接種的外植體棗芽在暗培養(yǎng)3～5 d后轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)，7～14 d開(kāi)始變綠和生長(zhǎng)，此時(shí)則可轉(zhuǎn)移到試管苗增殖培養(yǎng)基中。

2.2 試管苗的增殖培養(yǎng)

2.2.1 試管苗頂芽生長(zhǎng)后切段繁殖。沾化冬棗試管苗一般芽分化比較困難，側(cè)芽也很難萌發(fā)，往往形成單一的嫩梢，在MS+0.5 mg/L 6BA+0.25 mg/L IAA和MS+1 mg/L 6BA+0.2 mg/L IAA以及MS+2 mg/L 6BA+0.1 mg/L IAA這3個(gè)培養(yǎng)基上都能夠較好地生長(zhǎng)，進(jìn)行切段繁殖后，增殖系數(shù)為2.5～3.0。如果在這3個(gè)培養(yǎng)基中再加入有機(jī)營(yíng)養(yǎng)酪朊水解物（LH）200 mg/L，則試管苗正常生長(zhǎng)和增殖，并可起到壯苗的作用，切段增值系數(shù)為2.8～3.0，表現(xiàn)植株生長(zhǎng)快而且健壯，葉色較綠。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，切段繁殖也可以在生根的試管苗上進(jìn)行1～2次后，待側(cè)芽萌發(fā)0.5～1.0 cm后再移栽更好。因?yàn)樵嚬苊缁磕举|(zhì)化程度較高，根生長(zhǎng)好，移栽成活率高。

2.2.2 芽分化后分割繁殖。為了使試管苗基部分化出新的不定芽和側(cè)芽，以便進(jìn)行分割繁殖來(lái)提高增殖系數(shù)，試驗(yàn)制作了4個(gè)不同的增殖培養(yǎng)基配方，并采用莖尖（即頂芽）、基部愈傷、莖段以及帶柄葉片4種不同組織進(jìn)行沾化冬棗試管苗增殖試驗(yàn)。放冰箱經(jīng)低溫處理（從冰箱經(jīng)低溫處理的苗，腋芽啟動(dòng)率高，生長(zhǎng)整齊）。

由表1可知，以莖尖作材料時(shí)，4個(gè)培養(yǎng)基中其基部腋芽及頂部腋芽均能起動(dòng)，1號(hào)、2號(hào)培養(yǎng)基長(zhǎng)速相當(dāng)，長(zhǎng)勢(shì)較差；其中1號(hào)培養(yǎng)基腋芽生長(zhǎng)較細(xì)，3號(hào)培養(yǎng)基出現(xiàn)頂部腋芽較早且較多，4號(hào)培養(yǎng)基最好，基部及頂部腋芽起動(dòng)率高達(dá)82%，形成叢生芽，且長(zhǎng)速快、整齊，主莖粗壯，腋芽較細(xì)但利用率高。以基部愈傷作材料時(shí)，除在4號(hào)培養(yǎng)基上個(gè)別基部腋芽稍有起動(dòng)外，1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)培養(yǎng)基均未起動(dòng)。以莖段作材料時(shí)，1號(hào)、2號(hào)培養(yǎng)基腋芽起動(dòng)率低，長(zhǎng)速慢，不整齊，節(jié)間短但粗壯，平均轉(zhuǎn)苗期為30 d，3號(hào)培養(yǎng)基較成功，長(zhǎng)得粗壯，平均轉(zhuǎn)苗期為25 d，4號(hào)培養(yǎng)基最好，腋芽起動(dòng)率高，長(zhǎng)勢(shì)整齊，主莖粗壯。以帶柄葉片作材料時(shí)，4個(gè)培養(yǎng)基中均無(wú)腋芽起動(dòng)，葉子縱向卷曲變大。

2.3 試管苗的生根培養(yǎng) 由表2可知，冬棗試管苗生根培養(yǎng)基為4號(hào)培養(yǎng)基，如果將培養(yǎng)到2～3葉一心的試管苗剪斷接種到此培養(yǎng)基中，在20 ℃左右的光培養(yǎng)室中培養(yǎng)到20 d可以生根，生根率在95%以上，平均單株生根3.5條。但在同樣的條件下，以2～3片葉的試管苗，接種到1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 d后雖然能生根，但生根率低，不整齊，一般在75%。為了培養(yǎng)壯苗，在生根培養(yǎng)基中加入200 mg/L LH的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（即5號(hào)培養(yǎng)基），使苗莖粗壯，葉色濃綠，試管苗生根良好，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，平均單株生根3.5條。

2.4 試管苗的移栽 由表3可知，移栽的基質(zhì)不同，移栽成活率差異較大。將冬棗試管苗移栽到透氣、疏松和透水保水良好的基質(zhì)中，成活率明顯高于透氣性差易板結(jié)的基質(zhì)。用1號(hào)、4號(hào)和6號(hào)等基質(zhì)雖然移栽成活率較高，但后期長(zhǎng)勢(shì)欠佳，若用5號(hào)基質(zhì)移栽后長(zhǎng)勢(shì)越來(lái)越優(yōu)于其他基質(zhì)，表現(xiàn)為植株莖桿粗壯，葉色深綠，進(jìn)行田間第2次栽植成活率高。因此，認(rèn)為5號(hào)基質(zhì)是冬棗試管苗過(guò)渡移栽的最適基質(zhì)。為了促進(jìn)生長(zhǎng)，移栽后待幼苗長(zhǎng)出幼根和新葉后，對(duì)盆內(nèi)基質(zhì)追施2～3次1/10的MS大量元素營(yíng)養(yǎng)液。

移栽時(shí)期最好在春季3～5月，溫度在20 ℃左右，此時(shí)移苗成活率高達(dá)80%以上，且棗苗生長(zhǎng)旺盛。移栽方法可選用穴盤(pán)培養(yǎng)，即每穴種1棵試管苗，將蛭石加草炭（1∶1，V/V）預(yù)先裝入穴盤(pán)內(nèi)，種植苗后放在有彌霧裝置和遮陽(yáng)網(wǎng)的小拱棚內(nèi)，棚內(nèi)的空氣相對(duì)濕度控制在90%以上，1周后定時(shí)進(jìn)行通風(fēng)。待從穴盤(pán)移入大田時(shí)，試管苗的根系在穴盤(pán)內(nèi)生長(zhǎng)盤(pán)根錯(cuò)節(jié)，移苗時(shí)連同基質(zhì)一起種入田間，第2次移栽的成活率一般都在98%以上。