張 娜 劉 驍 莊廣儒

（湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東湛江 524000）

1 前言

傳染性皮下和造血器官壞死病是由傳染性皮下和造血器官壞死病毒（Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV）引起。IHHNV是目前已知最小的對(duì)蝦病毒，病毒粒子大小為20nm-22nm，是無(wú)囊膜的二十面體，線性單鏈DNA，估計(jì)長(zhǎng)度為4.1 kb，在CsCl中的濃度為1.40 g/mL，核衣殼蛋白至少由4個(gè)分子量分別為74 kD、47 kD、39 kD、37.5 kD 的多肽組成[1]。

IHHNV可感染大部分對(duì)蝦，并且感染后可造成極高的死亡率或嚴(yán)重影響生長(zhǎng)，使其畸形[2-3]，目前沒有有效的疫苗，也沒有有效的治療藥物。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將此病劃為須申報(bào)的甲殼類重要疾病之一，我國(guó)農(nóng)業(yè)部把其列為動(dòng)物二類動(dòng)物疫病。近年來(lái)隨著對(duì)蝦種苗和水產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易交流增多，種苗及親蝦的大量引進(jìn)增加了疫病在我國(guó)傳播的機(jī)會(huì)。

OIE的研究指出IHHNV至少有3個(gè)不同的基因型[4]，一是分離自美洲和東亞（主要是菲律賓），二是分離自東南亞，三是分離自馬達(dá)加斯加、印度、毛里求斯和澳大利亞（定為3A型）和分離自東非、莫桑比克和坦桑尼亞（定為3B型）。其中前兩個(gè)基因型為感染型IHHNV病毒株，而3A型和3B型為非感染型IHHNV病毒株，且現(xiàn)有OIE資料把3A型和3B型兩個(gè)基因型定義為假定IHHNV型（putative IHHNV），認(rèn)為這些假定IHHNV型是插入斑節(jié)對(duì)蝦基因組中的一段序列，并不感染南美白對(duì)蝦[5]。對(duì)IHHNV進(jìn)行分型時(shí)，2012年版OIE《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》推薦了309F/R和MG831R/F兩對(duì)引物，前者只與感染型IHHNV毒株（Ⅰ型和Ⅱ型）結(jié)合，后者與非感染型IHHNV病毒株結(jié)合。

為了更好地了解目前IHHNV的各種基因型，本研究根據(jù)IHHNV不同基因型的特異性引物，對(duì)一例進(jìn)境南美白對(duì)蝦親蝦進(jìn)行IHHNV病毒分型檢測(cè)，并對(duì)IHHNV各基因型序列進(jìn)行同源性比對(duì)，為IHHNV各基因型序列分析提供更多的數(shù)據(jù)。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)材料

湛江地區(qū)某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)隨機(jī)采取進(jìn)境南美白對(duì)蝦親蝦3尾。

2.1.2 試劑

rTaq 反應(yīng)酶、dNTP、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)物DL2000、瓊脂糖：均為大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司產(chǎn)品。

2.1.3 儀器設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀：德國(guó)Biometra公司；凝膠成像儀：德國(guó)Biometra公司；5417R高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf公司；電泳儀：DYY-8C，北京市六一儀器廠。

2.2 方法

2.2.1 樣品中病毒DNA抽提

將3尾活體蝦的鰓組織作為樣品，使用QIAGEN的DNA提取試劑盒提取DNA。

2.2.2 PCR引物合成

根據(jù)OIE推薦的的引物序列，由大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司合成。其中，389F/R：上游引物5’-CGG-AAC-ACA-ACC-CGACTT-TA-3’，下游引物5’-GGC-CAA-GACCAA-AAT-ACG-AA-3’；77012F/77353R：上游引物5’-ATC-GGT-GCA-CTA-CTC-GGA-3’，下游引物5’-TCG-TAC-TGG-CTG-TTCATC-3’；392F/R：上游引物5’-GGG-CGAACC-AGAATC-ACT-TA-3’，下游引物5’-ATCCGG-AGG-AAT-CTGATG-TG-3’；309F/R：上游引物5’-TCC-AAC-ACT-TAG-TCA-AAACCA-A-3’，下游引物5’-TGT-CTG-CTA-CG A-TGA-TTA-TCC-A-3’；MG831F/R：上游引物5’-TTG-GGG-ATG-CAG-CAA-TAT-CT-3’，下游引物5’-GTC-CAT-CCA-CTG-ATC-GGACT-3’。

2.2.3 PCR擴(kuò)增初篩

用引物389F/R、392F/R、77012F/77353R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL：10×PCR buffer 2.5μL，10×Mg2+（0.2mM) 2.5μL，上下游引物（40μmoL/L）各1.5μL，dNTP(各2.5mM)5μL，Taq酶0.5μL，模板5μL，然后加水至總體積到25μL。將反應(yīng)管至于PCR儀中，反應(yīng)程序如下：94℃ 4min預(yù)變性；94℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，32次循環(huán)；72℃10min，4℃ 保存。PCR擴(kuò)增物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

2.2.4 IHHNV病毒分型

引物309F/R和引物MG831F/R分別對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如2.2.3。

2.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與序列同源性比對(duì)

PCR擴(kuò)增條帶由上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別與NCBI中IHHNV基因序列比對(duì)。同時(shí)用DNAstar軟件對(duì)309F/R引物擴(kuò)增出來(lái)的序列與IHHNV福建分離株、夏威夷分離株、馬達(dá)加斯加分離株、坦桑尼亞分離株、泰國(guó)分離株進(jìn)行序列比對(duì)。

3 結(jié)果與討論

3.1 PCR擴(kuò)增初篩結(jié)果

以南美白對(duì)蝦親蝦鰓組織DNA為模板，389F/R 引物擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示一條大小約為389bp的特異性目的條帶，與預(yù)計(jì)大小一致 （見圖1）。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳分析-389bp片斷

3.2 用特異性引物進(jìn)行IHHNV基因分型結(jié)果

Tang[6]指出引物77012F、77353R擴(kuò)增的是IHHNV非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白之間的一段區(qū)域，引物392F/R和389F/R擴(kuò)增的是IHHNV ORF 1的一段序列，這兩對(duì)引物分別從IHHNV基因和假定IHHNV型擴(kuò)增出來(lái)的目的片斷同源性達(dá)100%，所以引物392F/R和389F/R是IHHNV進(jìn)行初篩的首選引物。選用309F/R引物進(jìn)行基因分型是因?yàn)镮HHNV基因組和IHHNV假定IHHNV型的基因組中ORF1的堿基變化（分別為8%和14%）高于ORF 2的堿基變化（分別為5%和9%），3A型和3B型的基因與309F/R引物不結(jié)合。

本研究以南美白對(duì)蝦親蝦鰓組織DNA為模板，用引物77012F和77353R、引物392F/R、引物MG831F/R和引物309F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示特異性目的條帶與預(yù)計(jì)大小一致，分別為356bp、392 bp、無(wú)條帶、309 bp （見圖2）。引物309F/R擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)大小一致的條帶，而引物MG831F/R在相應(yīng)位置沒有條帶，初步認(rèn)定所檢的南美白對(duì)蝦親蝦不是非感染型毒株（3A型和3B型）。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳分析-392bp、309bp片斷

3.3 擴(kuò)增片段同源性比對(duì)結(jié)果

將309F/R引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與NCBI中IHHNV基因序列比對(duì)，同源性達(dá)98%以上；同時(shí)采用DNAstar軟件將此測(cè)序結(jié)果與IHHNV福建分離株、夏威夷分離株、馬達(dá)加斯加分離株、坦桑尼亞分離株、泰國(guó)分離株基因序列比對(duì)，同源性分別為99%、98.7%、79.9%、90.6%和93.9%（見圖3），顯示分離的309bp序列與IHHNV非感染型毒株3A型（馬達(dá)加斯加分離株）和3B型（坦桑尼亞分離株）的同源性較低，而與感染型毒株（夏威夷分離株）同源性較高（>95%），進(jìn)一步證明樣品檢測(cè)出的是IHHNV感染型毒株。

圖3 樣品擴(kuò)增序列309bp同源性比對(duì)結(jié)果

4 結(jié)論

本研究使用5對(duì)引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，用引物MG831F/R和引物309F/R進(jìn)行樣品病毒分型，結(jié)果顯示引物309F/R擴(kuò)增出的309片斷，通過(guò)與IHHNV各基因型序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，證明樣品為IHHNV 感染型毒株，這為今后進(jìn)一步的檢測(cè)工作奠定了基礎(chǔ)。

［1］Bonami J R.Purification and characterisation of the infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus of Penaeid shrimps[J].General Virology,1990,71:2657-2664.

［2］Bray W A.The effect of salinity on growth and survival of Penaeus vannamei,with observations on the interaction of IHHN virus and salinity[J].Aquaculture,1994,122:133-146.

［3］Browdy C L.IHHN virus and intensive culture of Penaeus vannamei:effects of stocking density and water exchange rates[J].Crust Biol,1993,13:87-94.

［4］OIE.水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2012.

［5］Tang K F J,Poulos B T.Geographic variations among infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) isolates and characteristics of their infection[J].Diseases of Aquatic Organisms,2003,53:91-99.

［6］Tang K F J,Lightner D V.Detection and quantitation of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp by real-time PCR[J].Diseases of Aquatic Organisms,2001,49:79-85.