景宏麗 張 旻 王 娜 李 維 賈小波 方 瑩 高隆英 林祥梅 吳紹強(qiáng)*

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 北京 100029；2.蛇口出入境檢驗檢疫局）

1 前言

鯉春病毒血癥（Spring viraemia of carp，SVC）是一種由彈狀病毒感染，能夠引起數(shù)種鯉魚、鯉科魚類以及鯰科魚類急性出血和流行性敗血癥，春季SVC爆發(fā)時，幼齡鯉魚的死亡率可達(dá)70%。在奧地利、法國、德國、英國[1]、加拿大[2]和北美[3]等多個國家和地區(qū)均有SVC的相關(guān)報道，我國于2004年也首次報道了SVC[4]，目前該病已被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須申報的疫病[5]。SVC的病原是鯉春血癥病毒（Spring Viraemia of Carp virus ,SVCV），屬彈狀病毒科，暫被列入水皰病毒屬。該病毒基因組為不分節(jié)、負(fù)意義的單鏈RNA；基因組包含有11019個核苷酸，依次編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）、依賴RNA的RNA聚合酶（L）[6]。目前檢測該病毒的常用方法是先進(jìn)行病毒分離，然后用RT-PCR技術(shù)[7-9]或者其他方法[10-11]進(jìn)行鑒定。RT-PCR技術(shù)雖然具有高靈敏度的優(yōu)越性，但在結(jié)果判斷上易出現(xiàn)假陽性。OIE還推薦了一些檢測方法，即建立在單克隆抗體基礎(chǔ)上的間接免疫熒光技術(shù)（IF）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。近年來，一些學(xué)者建立了診斷SVC的商業(yè)試劑盒，主要是采用IF和ELISA兩種方法檢測幾種彈狀病毒，包括SVCV的幾種不同株。ELISA結(jié)果顯示試劑盒的特異性較差，而IF僅能檢測出4株SVCV中的一株[12]。為了提高抗體的特異性，有些學(xué)者也應(yīng)用了單克隆抗體技術(shù)。如2007年，邴國霞等制備了針對SVCV核蛋白的單克隆抗體[13]；國外學(xué)者S.Reschova等制備出了抗SVCV的G蛋白的單克隆抗體，但與另外一種彈狀病毒PFR有交叉反應(yīng)[14]。本研究旨在制備特異性強(qiáng)的抗SVCV單克隆抗體，以期研制有效的病毒鑒定方法，滿足我國水生動物檢疫工作的迫切之需。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

RPMI 1640：購于HyClone公司；特級胎牛血清：購于杭州四季青公司；HAT、HT、聚乙二醇（PEG1500）：均購于Gibco公司；二甲基亞砜、硫酸鹽TMB、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、弗氏完全佐劑和不完全佐劑：均購于Sigma公司；DAB發(fā)色液：購于天根公司；硝酸纖維素膜：購于PALL公司；SBA抗體分型試劑盒：美國 Shouthern Biotech生產(chǎn)；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

2.1.2 儀器

TS100倒置相差顯微鏡：Nikon公司；二氧化碳培養(yǎng)箱：SANYO公司；Avanti J-30I超速離心機(jī)：Beckman公司。

2.1.3 實驗動物及其他材料

SP2/0細(xì)胞、實驗中涉及的魚類細(xì)胞株和病毒株：均由本實驗室保存；BALB/c小鼠：購于北京軍事科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究院。

2.2 方法

2.2.1 抗原的制備和免疫小鼠

SVCV經(jīng)由EPC細(xì)胞在20℃擴(kuò)增，凍融一次后收集病毒懸液，經(jīng)過7000g 離心35 min，收集上清液，75000g差速離心5h，收集沉淀，用0.5mL的生理鹽水重懸。

免疫BALB/c小鼠，共免疫4次。具體免疫程序如下：①基礎(chǔ)免疫。病毒懸液與弗氏完全佐劑1:1混合，按每只0.1mL腹腔注射；②2周后加強(qiáng)免疫。病毒懸液與弗氏不完全佐劑1:1混合，每只腹腔注射0.1mL；③之后每隔1周再按同樣劑量腹腔注射加強(qiáng)免疫1次；④第4次免疫后第3天，將小鼠脫頸椎處死，無菌取脾臟用于細(xì)胞融合。

2.2.2 細(xì)胞融合

采用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合[15]：取免疫小鼠的脾臟細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞混合于融合管內(nèi)，100g離心5 min，棄上清液，輕振管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻，置于37℃水浴中預(yù)熱；用60 s時間緩慢加入1mL PEG1500溶液，邊加邊輕轉(zhuǎn)攪拌，然后緩慢加入改良型RPMI1640培養(yǎng)基，終止融合；70g離心6 min，棄上清液，加入HAT培養(yǎng)基；再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞分裝至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于45mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2.3 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選

當(dāng)雜交瘤細(xì)胞群落長到占培養(yǎng)板孔底1/3時，取細(xì)胞培養(yǎng)液上清液進(jìn)行檢測。使用經(jīng)過差速離心初步提純、濃縮的SVCV懸液包埋96孔ELISA板，抗原的包被濃度為4μg/mL，陰性對照為正常的細(xì)胞懸液，包被條件為4℃過夜；加入待測的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并37℃反應(yīng)90min后，洗滌，隨后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，洗滌；TMB發(fā)色液發(fā)色，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)；測定波長為450 nm時各孔的OD值(A450)，計算待測上清與病毒孔和細(xì)胞孔反應(yīng)后的OD值之比（P/N），當(dāng)P/N≥2.1時判定為陽性。

2.2.4 陽性雜交瘤細(xì)胞系的建立與腹水的制備

將檢測結(jié)果為陽性的雜交瘤細(xì)胞孔中的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并及時凍存，同時按照有限稀釋法進(jìn)行克隆，至陽性率為100%時，即可定株。然后，進(jìn)行腹水的誘生，主要是取6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按每只0.5mL腹腔內(nèi)注射無菌的液體石蠟；1周后，每只腹腔內(nèi)注射106個活的陽性雜交瘤細(xì)胞；接種雜交瘤細(xì)胞后7-10 d，小鼠腹部明顯膨大；用酒精棉球消毒下腹部皮膚后，用注射器抽取腹水。一般每只小鼠1 次可抽腹水1-5mL，間隔2-3 d，待腹水再生積蓄后，同法再抽，一般可抽1-3次。2000g離心10 min，收集水相上清液（不能吸取離心管最上層的油相物質(zhì)），-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 單克隆抗體免疫學(xué)特性的鑒定

2.3.1 mAb效價測定

用間接ELISA方法測定。收集的腹水2倍比系列稀釋，其測定步驟同2.2.3。

2.3.2 mAb的亞型分析

按照SBA抗體分型試劑盒使用說明書進(jìn)行測定。

2.3.3 mAb特異性測定

選取5種不同病毒和8種細(xì)胞株作為抗原包埋ELISA板，以測定所制備的抗SVCV腹水與它們的交叉反應(yīng)程度。

2.3.4 SDS-PAGE 和Western blot分析

獲得的mAb分別與差速離心純化的SVCV和EPC細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫印跡實驗，以分析抗體所識別的抗原表位。按照文獻(xiàn)常規(guī)方法[15]進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析，濃縮膠濃度為50g/L，分離膠濃度為120g/L；SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，用100/L脫脂奶粉4℃封閉過夜；洗滌后，加入腹水抗體（1:1500），37℃孵育1h；再次洗滌，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1:10000），37℃孵育1 h；經(jīng)過洗滌后，DAB顯色。

2.3.5 免疫過氧化酶染色

接種EPC細(xì)胞到24孔板上，待細(xì)胞長滿單層后，每孔加入100μL SVCV；35h后用固定液（30%丙酮和70%的酒精混合液）固定15min，加入單克隆抗體9C11（1:1000），37℃孵育90min；PBS-T洗滌3次，加入過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗鼠抗體IgG（1:200），37℃孵育90min后，洗滌3次；DAB發(fā)色。顯微鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立

細(xì)胞融合后，經(jīng)含HAT的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，產(chǎn)生200多個雜交瘤細(xì)胞；經(jīng)間接ELISA法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體，篩選出抗SVCV的陽性細(xì)胞株進(jìn)行克隆，獲得2株能穩(wěn)定分泌抗SVCV mAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為9C11和1C12。

3.2 單克隆抗體免疫學(xué)特性的鑒定

3.2.1 效價和亞型分析

間接ELISA法測得腹水的效價為104以上；抗體分型試劑盒檢測結(jié)果顯示所分泌的抗體亞型屬于Ig2b型，k鏈。

3.2.2 mAb的特異性測定

按照2.2.3節(jié)用ELISA方法把mAbs 9C11和1C12 分別與病毒性出血性敗血癥病毒（viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV)、鯉春病毒血癥病毒（Spring viremia of carp virus，SVCV）、傳染性造血組織器官壞死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）、狗魚幼魚彈狀病毒（pike fry rhabdovirus，PFRV)、草魚呼腸孤病毒（Grass Carp reovirus，GCRV）和流行性造血器官壞死病毒（epizootic haematopoietic necrosis virus,EHNV）以及8種魚類細(xì)胞株反應(yīng)，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：mAb 9C11和1C12均僅與SVCV反應(yīng)，與其他的病毒株和細(xì)胞株均不發(fā)生反應(yīng)。

表1 mAb 9C11和1C12與病毒及細(xì)胞的ELISA反應(yīng)結(jié)果（P/N值）

3.2.3 SDS-PAEG 和Western blot檢測

對mAbs抗原識別表位的初步分析結(jié)果表明：單抗對應(yīng)的抗原決定簇位點位于SVCV相對分子質(zhì)量（Mr）230 000的蛋白帶上（見圖1）。

圖1 SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果

3.2.4 免疫過氧化酶染色

經(jīng)鑒定SVCV接種鯉魚上皮瘤細(xì)胞（EPC）35h后，局部細(xì)胞出現(xiàn)深褐色，正常細(xì)胞未呈現(xiàn)顏色或僅顯很淺的本底色，如圖2箭頭標(biāo)示。A為低倍鏡下結(jié)果，B為高倍鏡下結(jié)果。

圖2 免疫過氧化酶染色

4 討論

免疫原是產(chǎn)生抗體的先決條件，故需選擇合適的方法和反應(yīng)條件來制備免疫原。應(yīng)用前人的蔗糖梯度離心的方法制備病毒抗原，雖然保證了病毒的純度，但是制備過程比較繁瑣，且含量比較低。在抗原的制備上，本研究選擇差速離心法，操作方便；在免疫方法上，采用免疫抑制的方法，彌補(bǔ)了病毒抗原制備上純度低的缺陷，保證了免疫效果。本實驗室在其他病毒抗體研制過程中也采用了類似的方法，取得了較好的免疫效果，但是具體機(jī)體對抗原產(chǎn)生耐受的機(jī)制或者原理還有待進(jìn)一步的證實。

單克隆抗體對比多克隆抗體最主要的優(yōu)勢是特異性高，本研究制備的抗SVCV的mAbs僅與SVCV反應(yīng)，與其他魚類細(xì)胞和魚類病毒株均不反應(yīng)。說明該mAbs具有較高的特異性。對比國內(nèi)外的其他學(xué)者的研究，本研究較全面地分析mAbs的特異性，無疑為mAbs的應(yīng)用和SVCV免疫學(xué)檢測方法的建立提供重要的理論基礎(chǔ)。另外，免疫過氧化酶染色實驗結(jié)果表明mAbs能夠特異性的檢測到細(xì)胞中的病毒，為后期免疫學(xué)方法的建立提供了堅實的基礎(chǔ)，也為后期進(jìn)一步研究病毒在宿主中的復(fù)制機(jī)制和過程提供了可能。

5 結(jié)論

本研究成功制備了抗SVCV的單克隆抗體，該抗體腹水效價均在104以上，且特異性高，與其他的病毒株和細(xì)胞株均沒有交叉反應(yīng)，今后可為該病毒的快速診斷及流行病學(xué)監(jiān)測提供檢測試劑。

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