馬 云 王明鑑 賈 臻 羅世芝 王海霞 郭 君 姚廣紅 王 茸 賈俊濤

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東青島 266002; 2.山東一品農(nóng)產(chǎn)集團(tuán)有限公司; 3.青島酒店管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院）

1 前言

沙門氏菌是最常見(jiàn)的食源性致病菌之一，在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首[1-3]。目前，沙門氏菌檢測(cè)的基準(zhǔn)方法仍是依賴于培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)的傳統(tǒng)方法，由于其耗時(shí)費(fèi)力，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程中的問(wèn)題，因此已不適應(yīng)生產(chǎn)的需要，迫切需要快速、準(zhǔn)確的“可替代方法”（alternative methods）用于食品原料、加工過(guò)程以及終產(chǎn)品的實(shí)時(shí)檢測(cè)。

可替代方法需與參照方法（基準(zhǔn)方法）進(jìn)行比較，以證明該方法對(duì)“預(yù)期目標(biāo)的適用性”，此過(guò)程稱為“方法驗(yàn)證”（validation of methods）。對(duì)于微生物檢測(cè)可替代方法的驗(yàn)證，國(guó)際上有明確的規(guī)范，如：ISO 16140:2003/Amd 1:2011《食品和動(dòng)物飼料微生物學(xué)-可替代方法的驗(yàn)證方案》（以下簡(jiǎn)稱“ISO 16140”）和《AOAC國(guó)際方法委員會(huì)關(guān)于食品和環(huán)境表面微生物方法的驗(yàn)證指南》等；國(guó)內(nèi)在方法驗(yàn)證方面僅有關(guān)于試劑盒評(píng)價(jià)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[4,5]，未見(jiàn)系統(tǒng)的相關(guān)報(bào)道。此外，方法驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可之間也存在著密切聯(lián)系[6]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可要求CNAS-CL01《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》（等同采用ISO/IEC 17025:2005）的規(guī)定：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)非標(biāo)準(zhǔn)方法、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)（制定）的方法、超出其預(yù)定范圍使用的標(biāo)準(zhǔn)方法、擴(kuò)充和修改過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行確認(rèn)（validation of methods，也即“方法驗(yàn)證”），以證實(shí)該方法適用于預(yù)期的用途。方法驗(yàn)證與能力驗(yàn)證、參考物質(zhì)一起并稱為質(zhì)量保證的三大“基石”[6]，應(yīng)當(dāng)引起實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員的重視。

方法驗(yàn)證包括“實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證”（即“實(shí)驗(yàn)室內(nèi)方法比較研究”）和“實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證”（即“實(shí)驗(yàn)室間協(xié)作研究”）兩大部分[7]。本研究依據(jù)ISO 16140，以賽默科技SureTect沙門氏菌實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法（以下簡(jiǎn)稱“SureTect方法”）為例，對(duì)其參照GB 4789.4-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（以下簡(jiǎn)稱“GB 4789.4”）進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證，以期詳細(xì)介紹沙門氏菌可替代方法實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證的具體程序，并為開(kāi)展類似實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證工作提供參考程序。本研究以一種沙門氏菌定性檢測(cè)方法為例進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證，僅僅是開(kāi)展方法驗(yàn)證工作過(guò)程中一次初步的嘗試，今后還需在微生物定量檢測(cè)方法的驗(yàn)證以及實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證方面開(kāi)展更深入細(xì)致的工作。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌株

包括沙門氏菌30株和干擾菌30株（見(jiàn)表1），主要來(lái)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）、中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）、中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC）及本實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)分離。

表1 菌株信息表

（續(xù)表）

2.1.2 主要儀器

生化培養(yǎng)箱（MIR-553）：日本三洋公司；實(shí)時(shí)PCR儀（SureTect）：賽默科技；恒溫?fù)u床（Excella E25R）：美國(guó)New Brunswich Scientific。

2.1.3 培養(yǎng)基及試劑

緩沖蛋白胨水（BPW）：美國(guó)OXOID公司；四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）、三糖鐵（TSI）瓊脂、賴氨酸脫羧酶瓊脂、尿素酶瓊脂、沙門氏菌生化鑒定管套裝、沙門氏菌O多價(jià)血清：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；菌落總數(shù)測(cè)試片：美國(guó)3M公司；SureTect 沙門氏菌PCR配套試劑盒（包括蛋白酶K、裂解試劑管和PCR管）：賽默科技。

2.2 方法

2.2.1 樣品基質(zhì)的制備

根據(jù)ISO 16140附表B.1，沙門氏菌可替代方法的驗(yàn)證應(yīng)選取肉、禽、水產(chǎn)品、果蔬和乳品等五大類食品為樣品基質(zhì)。樣品均購(gòu)自大型購(gòu)物超市，無(wú)菌包裝后在0-4℃條件下2h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。不同類別的樣品在無(wú)菌條件下分別混勻，0-4℃冷藏待用。

2.2.2 菌液的制備

所有菌株均取自-80℃冰箱，TSA-YE上37℃活化，挑取單菌落在TSA-YE上純化；再挑取純培養(yǎng)后的單菌落接種到10mL的BPW中，120rpm/min搖床培養(yǎng)24h；取1mL菌液加入9mL生理鹽水中，依次系列稀釋備用，同時(shí)用菌落總數(shù)測(cè)試片計(jì)數(shù)每個(gè)稀釋度菌液的濃度。

2.2.3 待驗(yàn)證方法——SureTect方法

樣品和BPW按1:9稀釋，在均質(zhì)器上混合均勻，于37℃±1℃培養(yǎng)20h-24h；吸取10μL試劑盒配套蛋白酶K溶液到SureTect裂解試劑管（預(yù)裝裂解液）中，再加入10μL BPW增菌肉湯，37℃孵育10min后立即于95℃孵育5min；吸取20μL裂解產(chǎn)物至PCR管（預(yù)裝SureTect凍干PCR試劑）中，復(fù)溶凍干試劑；PCR管放入儀器并運(yùn)行配套軟件，約1.5h后從軟件上讀取結(jié)果。

2.2.4 相對(duì)準(zhǔn)確性、相對(duì)特異性和相對(duì)靈敏度的測(cè)定和比較

相對(duì)準(zhǔn)確性是指可替代方法和參照方法對(duì)同一樣品檢測(cè)獲得結(jié)果的一致程度，相對(duì)靈敏度是指可替代方法能檢出參照方法確認(rèn)的分析物的能力，相對(duì)特異性是指可替代方法將參照方法確認(rèn)的非分析物排除的能力[7]。

這3個(gè)指標(biāo)驗(yàn)證過(guò)程如下：肉、禽、水產(chǎn)品、果蔬和乳品各稱取60個(gè)樣品，每個(gè)樣品25g，分別放于無(wú)菌均質(zhì)袋中。采用人工污染的方式制備樣品，嚴(yán)格控制樣品的污染水平（大約在0-10CFU/g），干擾菌株的添加水平比陽(yáng)性菌株高約一個(gè)數(shù)量級(jí)。每個(gè)樣品添加1mL稀釋好的沙門氏菌菌液和1mL干擾菌菌液，混合均勻。采用SureTect方法和GB4789.4同時(shí)檢測(cè)每一個(gè)樣品。記錄所有檢測(cè)結(jié)果，按下列公式[7]計(jì)算SureTect方法相對(duì)準(zhǔn)確性、相對(duì)特異性和相對(duì)靈敏度：

式中：AC—相對(duì)準(zhǔn)確性；SP—相對(duì)特異性；SE—相對(duì)靈敏度；PA—陽(yáng)性符合（真陽(yáng)性）的數(shù)目；PD—陽(yáng)性偏差（假陽(yáng)性）的數(shù)目；ND—陰性偏差（假陰性）的數(shù)目；NA—陰性符合（真陰性）的數(shù)目。

按照ISO 16140 附件F的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法判斷兩種方法相對(duì)準(zhǔn)確性、相對(duì)特異性和相對(duì)靈敏度的一致性。

2.2.5 相對(duì)檢測(cè)限的測(cè)定和比較

混勻的肉、禽、水產(chǎn)品、果蔬和乳品各稱取18個(gè)樣品，每個(gè)樣品25g，放于無(wú)菌均質(zhì)袋中。每類食品的18個(gè)樣品平均分成3組，3組分別接種沙門氏菌菌液達(dá)到不同污染水平（0、約0.04CFU/g和約0.12CFU/g），每個(gè)樣品分別用兩種方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)菌落總數(shù)測(cè)試片計(jì)數(shù)獲得的菌液原始濃度換算出后兩個(gè)水平樣品污染菌的濃度；根據(jù)3個(gè)污染水平的檢出情況和3個(gè)污染水平的菌濃度報(bào)告方法的相對(duì)檢出限，用Fisher確切概率法[8]檢驗(yàn)每一水平上兩種方法相對(duì)檢測(cè)限的差異。

2.2.6 包含性和排他性試驗(yàn)

按照ISO 16140附件G的原則選取30株沙門氏菌作為目標(biāo)菌，同時(shí)選取30株近似菌作為干擾菌。所有菌株在試驗(yàn)前需經(jīng)生化、血清或分子生物學(xué)鑒定，每株測(cè)試菌株接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行測(cè)試。目標(biāo)菌的接種水平是待驗(yàn)證方法相對(duì)檢測(cè)限的10到100倍，干擾菌的接種水平為預(yù)計(jì)樣品中細(xì)菌最大污染水平（確定為約105CFU/g）。當(dāng)待驗(yàn)證方法對(duì)目標(biāo)菌的測(cè)試出現(xiàn)假陰性時(shí)，應(yīng)對(duì)該菌重新測(cè)試，并同時(shí)采用GB 4789.4方法驗(yàn)證；當(dāng)對(duì)干擾菌的測(cè)試出現(xiàn)假陽(yáng)性或可疑時(shí)，僅采用被驗(yàn)證方法對(duì)該菌重新測(cè)試。記錄所有檢測(cè)結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 相對(duì)準(zhǔn)確性、相對(duì)特異性和相對(duì)靈敏度

可替代方法實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證過(guò)程中的相對(duì)準(zhǔn)確性、相對(duì)特異性和相對(duì)靈敏度與傳統(tǒng)的方法準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度概念不同。前者是對(duì)很低污染水平（檢出限附近）的樣品檢測(cè)后與參照方法的檢測(cè)結(jié)果比較后獲得，容易出現(xiàn)假陰性的情況；而后者則是對(duì)較高污染水平的樣品檢測(cè)后與預(yù)期結(jié)果（通常不是參照方法獲得的結(jié)果）比較后獲得，通常呈現(xiàn)高度一致（接近100%）。

對(duì)于5類人工污染的食品樣品，分別采用SureTect方法和GB 4789.4同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 SureTect方法的相對(duì)準(zhǔn)確性、相對(duì)特異性和相對(duì)靈敏度的計(jì)算

表2顯示，SureTect方法的相對(duì)準(zhǔn)確性、相對(duì)特異性和相對(duì)靈敏度均偏低，最低為75%，需根據(jù)ISO16140附件F的檢驗(yàn)方法來(lái)確定SureTect方法與GB 4789.4是否存在差異。

由表2可得出5類食品都符合6≤Y（Y=PD+ND）≤22的情況，PD和ND中較小的值

都大于ISO 16140附表F.1中的M值，因此可以判定兩種方法之間無(wú)顯著性差異（α<0.05）。

3.2 相對(duì)檢測(cè)限

分別采用SureTect方法和GB 4789.4同時(shí)檢測(cè)3個(gè)不同污染水平樣品，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 SureTect方法相對(duì)檢測(cè)限的計(jì)算

根據(jù)接種菌液計(jì)數(shù)結(jié)果推算，水平1接種濃度是0，水平2接種濃度約是0.03CFU/g，水平3接種濃度約是0.10CFU/g。由于水平1結(jié)果全部為陰性，不能用于相對(duì)檢測(cè)限，SureTect方法的相對(duì)檢測(cè)限位于水平2和水平3之間（0.03CFU/g-0.10CFU/g），即樣品中沙門氏菌達(dá)到0.75（0.03×25）CFU-2.5（0.10×25）CFU就可能在BPW中增殖并被SureTect實(shí)時(shí)PCR方法檢出。

表3中所有P值都大于0.05，因此在α=0.05水平，對(duì)于所有5類食品類別，兩種方法的相對(duì)檢測(cè)限都無(wú)顯著性差別；5類食品基質(zhì)對(duì)檢測(cè)限幾乎沒(méi)有影響。

在判斷兩種方法是否一致的檢驗(yàn)過(guò)程中，通常設(shè)計(jì)四格列聯(lián)表進(jìn)行X2檢驗(yàn)，但是當(dāng)理論頻數(shù)小于5或總觀測(cè)頻數(shù)小于30時(shí)，X2檢驗(yàn)不適用，需要采用Fisher確切概率檢驗(yàn)法。Fisher確切概率檢驗(yàn)計(jì)算繁瑣，本研究采用MATLAB（R2009b版，美國(guó) Mathworks公司）程序運(yùn)行M文件自動(dòng)完成檢驗(yàn)。Fisher確切概率法的M文件下載自http://www.mathworks.cn/matlabcentral/fileexchange/5957-fisherextest。為確保該M文件的準(zhǔn)確性，該文件經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后再用于Fisher確切概率檢驗(yàn)。

3.3 包含性和排他性

根據(jù)ISO 16140，包含性是指可替代方法從許多菌株中識(shí)別出目標(biāo)分析物的能力，而排他性是指可替代方法對(duì)非目標(biāo)菌株抗干擾的能力。分別采用SureTect方法和GB 4789.4同時(shí)檢測(cè)30株沙門氏菌和30株干擾菌獲得該可替代方法的包含性和排他性指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 SureTect方法的包含性和排他性結(jié)果數(shù)據(jù)表

除了干擾菌中一株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌Yersinia enterocolitica CMCC52203被SureTect方法檢測(cè)為陽(yáng)性外，兩種方法檢測(cè)結(jié)果均一致。在檢測(cè)工作中，出現(xiàn)假陰性不可接受，會(huì)造成“漏檢”；而偶爾出現(xiàn)假陽(yáng)性可以接受，因其并不影響工作質(zhì)量，只是增大了檢測(cè)工作量。因此，即使結(jié)果中出現(xiàn)了一次假陽(yáng)性，SureTect方法的包含性和排他性也可滿足檢測(cè)工作需要。

方法的包含性和排他性與前面提到的方法的準(zhǔn)確性、靈敏性和特異性存在著相似性，都是依靠對(duì)一定數(shù)量的陽(yáng)性和陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)來(lái)判斷檢測(cè)方法的性能，體現(xiàn)的是方法識(shí)別目標(biāo)分析物和排除干擾物的能力。但是，包含性和排他性針對(duì)的是純培養(yǎng)的菌，而準(zhǔn)確性、靈敏性和特異性針對(duì)的卻是污染有特定菌株的檢測(cè)樣品。

3.4 方法驗(yàn)證中的條件選擇

3.4.1 沙門氏菌檢測(cè)方法驗(yàn)證中食品基質(zhì)的選取

沙門氏菌的方法驗(yàn)證需以人工污染的方式制備樣品，制備樣品時(shí)需接種特定濃度的沙門氏菌到食品基質(zhì)中。對(duì)于不同微生物檢測(cè)方法的驗(yàn)證，需要選取不同的食品基質(zhì)。ISO 16140的附表B.1對(duì)各類別（categories）食品的不同種類（types）可能污染的微生物指標(biāo)做出了歸納，方法驗(yàn)證時(shí)應(yīng)針對(duì)微生物種類優(yōu)先選取其對(duì)應(yīng)的食品類別中推薦的種類。例如，對(duì)于沙門氏菌方法驗(yàn)證，食品基質(zhì)應(yīng)選?。ɡㄌ?hào)外為食品類別，括號(hào)內(nèi)為食品種類）：肉（生肉）、禽（生禽）、水產(chǎn)品（生水產(chǎn)品）、果蔬（鮮果蔬、果汁/濃縮汁）、乳品（鮮、凍、發(fā)酵和干制乳品）、巧克力/烘焙產(chǎn)品（低水分、干制的）、其他（調(diào)味料、蛋黃醬、蛋品）、動(dòng)物飼料（混合）。只有選取了附表B.1中所有推薦類別和種類，驗(yàn)證的方法才能稱其適用于所有食品。本研究選取了前幾類進(jìn)出口量較大的幾種食品類別為代表進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果適用于大多數(shù)食品類別。此外，對(duì)于每一類食品類別，必須達(dá)到60個(gè)樣品才能用于相對(duì)準(zhǔn)確性、相對(duì)特異性和相對(duì)靈敏度的分析[7]。

3.4.2 沙門氏菌檢測(cè)方法驗(yàn)證用菌株的選取

用于方法驗(yàn)證的沙門氏菌應(yīng)盡可能選取來(lái)源于不同菌種保藏機(jī)構(gòu)、不同地域、不同食品基質(zhì)的不同血清型菌株。多樣的沙門氏菌菌株可以保證驗(yàn)證的廣泛性。干擾菌株主要包括與沙門氏菌相近的、有較強(qiáng)干擾性的菌株，如志賀氏菌等腸桿菌科細(xì)菌和腸桿菌科之外的細(xì)菌。在包含性和排他性的驗(yàn)證試驗(yàn)中，對(duì)于沙門氏菌檢測(cè)方法應(yīng)至少選取30株目標(biāo)純培養(yǎng)物；而對(duì)于其他菌的檢測(cè)方法，應(yīng)至少選取50株目標(biāo)純培養(yǎng)物[7]。

3.4.3 食品基質(zhì)污染水平的控制

方法驗(yàn)證過(guò)程中，樣品基質(zhì)的污染水平受到嚴(yán)格控制。對(duì)于相對(duì)準(zhǔn)確性、相對(duì)特異性和相對(duì)靈敏度的測(cè)定，污染水平大約控制在0-10CFU/g[7]，其目的是為了確保預(yù)期大約一半的樣品出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果；如果全部出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果或者全部出現(xiàn)陰性結(jié)果，這些指標(biāo)將會(huì)為0或100%，表明驗(yàn)證失敗。對(duì)于相對(duì)檢測(cè)限的測(cè)定，污染水平應(yīng)控制達(dá)到如下程度：第一個(gè)水平是陰性對(duì)照（不接種沙門氏菌）；第二個(gè)水平是理論上的檢測(cè)限（約0.04CFU/g，即25g樣品中存在1CFU）；第三個(gè)水平略高于理論檢測(cè)限（定為3倍的理論檢測(cè)限，約0.12CFU/g）[7]。對(duì)于方法的包含性和排他性試驗(yàn)，目標(biāo)菌的接種水平最高，確定為待驗(yàn)證方法相對(duì)檢測(cè)限的10到100倍[7]。

3.4.4 可替代方法和參照方法步驟不同時(shí)的選擇

ISO 16140中規(guī)定：“對(duì)同一樣品采用可替代方法和參照方法同時(shí)檢測(cè)”。對(duì)于兩種方法的第一步增菌液相同時(shí)，這一規(guī)定可以滿足。本研究中，兩種方法第一步使用的增菌液都是BPW，可以從同一份BPW分別吸取一定體積的增菌液進(jìn)行后續(xù)分析。然而對(duì)于有的檢測(cè)項(xiàng)目，第一步使用的增菌液不一致，就無(wú)法直接用兩種方法同時(shí)檢測(cè)同一個(gè)樣品。ISO 16140附件D.2給出了解決辦法：對(duì)于液體樣品，取2倍檢測(cè)用量（例如，50mL）徹底均質(zhì)后等分成2份再分別按兩種方法的后續(xù)檢測(cè)步驟繼續(xù)檢測(cè)；而對(duì)于非液體樣品，則稱取2倍質(zhì)量的樣品（例如，50g）加入等量稀釋液（例如，50mL）徹底混勻，然后等分成2份，分別加入兩種不同的增菌液（注意保持正確的增菌液比例），再分別按兩種方法的后續(xù)檢測(cè)步驟繼續(xù)檢測(cè)。

4 結(jié)論

依據(jù)ISO 16140，以SureTect沙門氏菌實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法為例，將其與沙門氏菌國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證，兩種方法在相對(duì)準(zhǔn)確性、相對(duì)特異性、相對(duì)靈敏度和相對(duì)檢測(cè)限等指標(biāo)上無(wú)顯著性差異，包含性和排他性也基本一致。本研究詳細(xì)展示了沙門氏菌可替代方法實(shí)驗(yàn)室內(nèi)驗(yàn)證的具體程序并對(duì)驗(yàn)證程序中關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行了探討，對(duì)于今后類似驗(yàn)證工作的開(kāi)展提供了參考。

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