曹冬梅 袁慕云 史媛媛 劉 洋 許龍巖 曹際娟*

（1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局 遼寧大連 116001；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局）

1 前言

沙門氏菌（Salmonella）是人類重要的腸道致病菌，也可在動(dòng)物腸道中繁殖或引起疾病。目前已知的沙門氏菌有2500多個(gè)血清型，在中國發(fā)現(xiàn)了200多個(gè)血清型。沙門氏菌所致疾病中最常見的一類是急性胃腸炎，可由不同菌型引起，以鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）、腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis）、湯卜遜沙門氏菌（Salmonalla thompson）等最為常見；另一類重要疾病是傷寒和副傷寒（統(tǒng)稱腸熱癥），它們是一種獨(dú)特的急性全身性發(fā)熱性單核細(xì)胞內(nèi)感染，由傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhi）及甲型、乙型和丙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi）等引起，其中傷寒沙門菌是最常見的引發(fā)傷寒疾病的血清型，與食物中毒有直接關(guān)系；此外，還有敗血癥，由豬霍亂沙門氏菌（Salmonella Choleraesuis）等引起。

本研究小組已經(jīng)建立了針對(duì)鼠傷寒沙門氏菌[1,2]、腸炎沙門氏菌[3]、副傷寒沙門氏菌[4]、豬霍亂沙門氏菌[4]、雞傷寒沙門氏菌[5]等基于TaqMan探針實(shí)時(shí)PCR和焦磷酸測(cè)序技術(shù)的快速檢測(cè)方法，可以實(shí)現(xiàn)快速鑒定。鑒于目前傷寒沙門氏菌鑒定主要是依靠傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，即選擇性增菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型，通常要5-6天才能得出檢測(cè)結(jié)果，不利于及時(shí)診斷、查找病源，控制病情的蔓延。因此，本研究針對(duì)傷寒沙門氏菌設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)的引物和TaqMan探針，并以雞肉、魚肉、豬肉為模擬樣品，開展實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法的研究，以期快速、準(zhǔn)確鑒定傷寒沙門氏菌。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)菌株

不同血清型的沙門氏菌共60株，其中1株傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，30株傷寒沙門氏菌分離株，27株其他血清型沙門氏菌，7株大腸埃希氏菌等非沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（具體菌株信息見表1）。上述菌株均采用API 20E 試劑條和血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行確證。

表1 菌株信息表

（續(xù)表）

2.1.2 主要試劑

TTB增菌液、BP緩沖蛋白胨水：北京陸橋技術(shù)有限公司；PCR用緩沖液、Taq DNA聚合酶、ROX、dNTP：寶生物工程（大連）有限公司。

2.1.3 主要儀器

實(shí)時(shí)熒光PCR：ABI 7500，美國；核酸提取儀：E7001，日本PPS公司。

2.2 方法

2.2.1 引物探針的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的傷寒沙門氏菌基因序列，采用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，特異性擴(kuò)增傷寒沙門氏菌。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成，序列見表2。

表2 引物和探針信息表

2.2.2 DNA提取和特異性試驗(yàn)

所有沙門氏菌菌株采用BP緩沖蛋白胨水37℃培養(yǎng)10h，取10mL接種于TTB增菌液，44.5℃培養(yǎng)18h，取1mL菌懸液移入離心管，12000 r/min離心5min去上清，用1mL去離子水漂浮沉淀，12000 r/min離心3min去上清，重復(fù)兩次，最后加200μL去離子水在核酸提取儀上提取DNA，用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。非沙門氏菌陰性對(duì)照菌株用相應(yīng)的培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，取1mL菌懸液移入離心管，按上述步驟提取DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。所有菌株的DNA用于傷寒沙門氏菌的特異性實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系和參數(shù)

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為30μL，其中模板DNA1μL、10 ×TaqMan緩沖液4μL、5mmol/LMgCl22μL、2.5mmol/L dNTPs 3μL、TaqMan探針20μmol/l1μL、正向和反向引物20μmol/l各1μL（共2μL）、UNG酶(0.55U)0.2μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)3μL、去離子水13.8μL。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃30s，95℃5s，60℃34s，40個(gè)循環(huán)。

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯、Ct<37為陽性判定原則。其中以Ct<35 且擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯可直接判定為陽性；Ct值在35-37之間判斷為可疑，需要加大模板量進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，如出現(xiàn)指數(shù)期明顯的擴(kuò)增曲線方可判定為陽性，否則為陰性。

2.2.4 模擬樣品檢測(cè)和靈敏度試驗(yàn)

取雞肉、魚肉、豬肉樣品，采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》GB4789.4-2010進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，確認(rèn)無沙門氏菌污染。然后分別秤取25g 雞肉、魚肉、豬肉，每份樣品中分別添加不同濃度的傷寒沙門氏菌菌懸液（以未添加菌液的樣品作為陰性對(duì)照），制成12份模擬樣品。在每份樣品中加入225mL緩沖蛋白胨水，用拍打器拍打2min，37℃ 培養(yǎng)10h，取10mL移入90mL TTB增菌液，44.5℃培養(yǎng)18h，然后取增菌液提取DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。同時(shí)，不同濃度的模擬污染樣品也用于實(shí)時(shí)PCR方法的檢測(cè)靈敏性試驗(yàn)。所有模擬樣品按照GB4789.4-2010與實(shí)時(shí)熒光PCR方法同步進(jìn)行培養(yǎng)鑒定。

3 結(jié)果

3.1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

取表1中所列的1株傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、30株傷寒沙門氏菌分離株、27株其他血清型沙門氏菌以及7株大腸埃希氏菌等非沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA，采用表2中的檢測(cè)引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖1。

圖1 傷寒沙門氏菌特異性試驗(yàn)的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增圖譜

圖1顯示，31株傷寒沙門氏菌的DNA樣本經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，均檢出陽性增幅曲線；27株其他血清型沙門氏菌、7株非沙門氏菌的DNA樣本的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明所設(shè)計(jì)的傷寒沙門氏菌檢測(cè)引物和探針具有很好的特異性。

以傷寒沙門氏菌（CMCC 50071）菌株的系列稀釋DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果（見表3）顯示，傷寒沙門氏菌菌株的模板濃度與Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性系數(shù)（R2）為0.994，擴(kuò)增效率為94.5%。

表3 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效率

3.2 模擬樣品檢測(cè)和靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

12份按不同濃度添加的模擬污染樣品，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，均擴(kuò)增出與預(yù)期相符的傷寒沙門氏菌陽性增幅曲線，檢測(cè)結(jié)果的Ct值見表4。同時(shí)，按照GB4789.4-2010 檢測(cè)模擬污染樣品，均分離鑒定出傷寒沙門氏菌，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果相同。

表4 模擬污染傷寒沙門氏菌樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

從表4不同添加菌液濃度的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果可見，傷寒沙門氏菌模擬污染樣品的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到4cfu/mL的添加濃度。

4 討論

沙門氏菌的傳統(tǒng)方法鑒定需要經(jīng)過病原的初步分離、生化鑒定并結(jié)合血清學(xué)分型，因此存在一定比例的假陽性等問題[6-8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有針對(duì)invA、16s rRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEFl4、sefA、sdf、ssaQ、fimY[9-18]等為目標(biāo)基因，用普通PCR或?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)沙門氏菌的報(bào)道，但以上述方法只能檢測(cè)沙門氏菌的毒力基因，不能確定血清型。杜邦公司的Bax系統(tǒng)利用熒光PCR技術(shù)從種的水平上檢測(cè)沙門氏菌，具有較高的特異性，但同樣不能確定血清型。Camila等[19]針對(duì)ompC、SdfI、ViaB、Spy為目的基因設(shè)計(jì)引物，建立了多重PCR檢測(cè)沙門氏菌及其主要血清型（腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌）的方法，應(yīng)用于雞肉中的沙門氏菌檢測(cè)；KIM[20]等也根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌的特異序列設(shè)計(jì)多對(duì)引物，建立了多重PCR檢測(cè)方法，均得到較好的效果。但上述方法需通過凝膠電泳判定結(jié)果，操作較為繁瑣。Edel等[21]用flic、sefA、sdf、acek基因設(shè)計(jì)引物探針，用多重?zé)晒釶CR方法檢測(cè)腸炎沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌等；David[22]等用普通PCR和熒光PCR檢測(cè)豬霍亂沙門氏菌和丙型副傷寒沙門氏菌。從上述可見，有關(guān)開展分子生物學(xué)快速檢測(cè)傷寒沙門氏菌的報(bào)道很少。

5 結(jié)論

本研究建立的TaqMan探針實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)食品中傷寒沙門氏菌的方法具有很好的特異性、快捷性，模板濃度與Ct值有良好的線性關(guān)系，熒光PCR擴(kuò)增效率高，線性系數(shù)（R2）為0.994，檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到4cfu/mL的添加濃度；經(jīng)模擬樣品驗(yàn)證，所建立的實(shí)時(shí)PCR方法與傳統(tǒng)方法的檢測(cè)結(jié)果相一致。本方法具有檢測(cè)周期短，操作簡便的優(yōu)勢(shì)，可以快速鑒定傷寒沙門氏菌，在快速診斷病原、控制病情等方面具有很好的應(yīng)用前景。

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