曾 靜 時逸吟* 張孝剛 唐 玲 朱 堅 伊雄海 鄧曉軍 曲 栗

（1.上海出入境檢驗檢疫局 上海 200135；2.遵義醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院）

1 前言

肌醇（Inositol）又叫1α，2α，3α，4β，5α，6β-環(huán)己六醇，分子式為C6H12O6，結(jié)構(gòu)式如圖1。肌醇是飽和環(huán)狀多元醇，易溶于水，廣泛存在于各種天然動物、植物及微生物組織中[1]，具有類似維生素B1和維生素H的作用，能促進脂肪代謝，防止肝臟脂肪積累，加速除去肝臟過多脂肪，對脂肪肝、肝炎、肝硬化癥、糖尿病、肥胖癥等疾病有治療和預防作用[2]。因此，肌醇可作為食品營養(yǎng)強化劑，被允許在調(diào)制乳粉（僅限兒童用乳粉）、果蔬汁（肉）飲料（包括發(fā)酵型產(chǎn)品等）和風味飲料限量添加[3]，其中國家標準《嬰幼兒配方食品》（GB 10765-2010）規(guī)定嬰幼兒配方食品中肌醇的添加量為1.0-9.5mg/100kJ[4]。

圖1 肌醇分子結(jié)構(gòu)

目前有關(guān)文獻報道的肌醇檢測方法有重量法、高碘酸鉀氧化法、微生物法、液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（GCMS/MS）[5-14]。這些方法中，重量法所需樣品量大，操作繁瑣；高碘酸鉀氧化法需要嚴格控制加熱氧化時間；微生物法耗時長；HPLC法的分離效果不如GC法，檢測結(jié)果誤差較大。食品安全國家標準《嬰幼兒食品和乳品中肌醇的測定》（GB 5413.25-2010）[15]明確規(guī)定嬰幼兒食品和乳品中肌醇含量的測定方法為微生物法和氣相色譜法

，國家推薦標準《保健食品中肌醇的測定》（GB/T 5009.196-2003）[5]采用的方法也是硅烷化處理后氣相色譜檢測法。但是由于奶粉基質(zhì)復雜，雜峰會干擾目標化合物，從而影響檢測結(jié)果的準確性。

本研究按照國家標準檢測步驟，采用固相萃取技術(shù)，以期通過優(yōu)化肌醇測定的前處理過程，找到現(xiàn)有方法中雜峰干擾的解決辦法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗材料市售奶粉。

2.1.2 試劑

肌醇標準品：純度≥99%，購自Sigma公司；N,N-二甲基甲酰胺、六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷、正己烷、無水乙醇：均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

2.1.3 儀器設(shè)備

Agilent 7890A氣相色譜儀：帶FID檢測器，安捷倫科技有限公司；HWS28電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；centrifuge 5810R離心機：德國Eppendorf公司；氮吹儀：美國Zymark公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；渦旋振蕩器：VISION SCIENTIFIC CO.，LTD；超聲波清洗儀：德國Elmasonic；LC-Florisil固相萃取小柱（1g/3mL）、LC-CN固相萃取小柱(1g/3mL)：上海安譜科學儀器有限公司。

2.2 方法

2.2.1 肌醇標準溶液（0.010mg/mL）配制

稱取100mg（精確到0.1mg）肌醇標準品，經(jīng)105℃烘干2h，用25mL水溶解完全，95%乙醇定容至100mL；取1mL此溶液，用70%乙醇定容至100mL。

2.2.2 氣相色譜條件

色譜柱：SP-2560毛細管柱（100m×0.25mm，0.2μm）；進樣口溫度：280℃；進樣方式：分流進樣；分流比：10:1；柱溫：120℃保持0min，以10℃/min升到190℃，保持20min，再以10℃/min升到220℃，保持3min；檢測器：FID（氫火焰離子檢測器），溫度300℃；H2流量：30mL/min；空氣流量：400mL/min；尾吹流量（N2）：25mL/min。

2.2.3 樣品處理

參照國家標準GB 5413.25-2010[5]。稱取試樣1g(精確到0.0001g)于50mL容量瓶中，加入12mL40℃溫水溶解試樣；超聲提取10min，用95%乙醇定容；取10mL于15mL離心管中，離心5min；取上清液5mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入10mL硅烷化試劑，超聲溶解，于80℃水浴中衍生反應75min；取出冷卻至室溫，加入5mL正己烷，振蕩混合，取上清液供氣相色譜測定。

2.2.4 標準曲線的制備

分別吸取0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL肌醇標準溶液于濃縮瓶中，按照2.2.3步驟操作。

2.2.5 固相萃取柱的選擇及凈化條件和步驟

分別采用LC-CN固相萃取小柱和LC-Florisil固相萃取小柱凈化處理樣品后，再進行干燥與衍生的后續(xù)分析。固相萃取凈化條件和步驟：選用5mL乙醇對固相萃取柱進行活化，5mL 70%乙醇進行平衡，然后加1mL提取液上樣，先以1mL 乙醇淋洗，棄去淋洗液，再以2mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液。

2.2.6 樣品測定

分別將待測液注入到氣相色譜儀中，按上述色譜條件進行分析。

2.2.7 結(jié)果計算

外標法定量，計算樣品中肌醇含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 肌醇標準曲線

根據(jù)標準曲線步驟測定，以肌醇濃度（0，0.004mg/mL，0.008 mg/mL，0.012 mg/mL，0.016 mg/mL，0.02 mg/mL）為橫坐標，以氣相色譜峰面積為縱坐標，繪制肌醇含量測定的標準曲線，如圖2。肌醇標準曲線測定的代表性圖譜如圖3。

圖2 肌醇的標準曲線

圖3 肌醇標準曲線測定代表性圖譜（肌醇濃度0.016mg/mL）

圖2顯示，在0-0.02 mg/mL范圍內(nèi)，肌醇濃度和肌醇檢測色譜峰面積具有良好的線性相關(guān)性，r為0.9996。在此濃度范圍內(nèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)對肌醇的準確定量檢測。

3.2 不同固相萃取柱處理樣品對肌醇測定的影響

通過添加10 mg/100g水平，比較國標法（不經(jīng)固相萃取柱凈化）和本方法（經(jīng)凈化）的分析結(jié)果（圖4）以及LC-CN Spe小柱和LC-Florisil Spe小柱柱效（圖5）。

圖4 未經(jīng)SPE凈化與經(jīng)凈化對樣品處理對比圖

圖5 兩種小柱對樣品凈化效果對比圖

圖4顯示，國標法中由于樣品不經(jīng)凈化處理，所以雜峰較多，對實際樣品的測定有一定干擾，樣品出峰前有其他尾峰影響峰面積；本方法中經(jīng)凈化處理的樣品雜峰較少，受樣品基質(zhì)影響小。圖5顯示，兩種小柱對樣品凈化效果無顯著差異，均能達到對實際樣品的凈化，減少雜質(zhì)。實際測定數(shù)據(jù)見表1。

表1 2種固相萃取小柱分析結(jié)果

根據(jù)實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測標準[16]，回收率最好在95-105%。表1顯示，LC-CN 固相萃取小柱表觀回收率較高，超過105%，這可能是凈化不完全導致；而LC-Florisil 固相萃取小柱回收率基本在95-105%范圍內(nèi)，同時過LC-Florisil固相萃取小柱比LC-CN固相萃取小柱快。這是因為肌醇是極性物質(zhì)，LC-Florisil固相萃取柱是極性柱，經(jīng)淋洗后試樣中的肌醇被LC-Florisil固相萃取柱吸附，而雜質(zhì)則隨淋洗液流出并棄之。

3.3 衍生前后固相萃取處理樣品對肌醇測定的影響

根據(jù)國標中肌醇的測定步驟，選擇LC-Florisil固相萃取小柱、固相萃取凈化條件和步驟，分別于衍生前處理樣品和衍生后處理樣品，分析2種處理對分析結(jié)果的影響。測定結(jié)果見表2，分析圖譜見圖6。

表2 衍生前后固相萃取處理樣品對肌醇測定的影響

圖6 衍生前后固相萃取處理樣品對肌醇測定的影響

通過分析可知，衍生前凈化與衍生后凈化對樣品中肌醇含量測定結(jié)果的影響無顯著差異，均具有較高的準確性和重現(xiàn)性。但僅從數(shù)字看，衍生前進行樣品凈化具有更好的效果。

3.4 實際樣品測定

采用國標法和本方法（選擇LC-Florisil 固相萃取小柱）分別對樣品1、樣品2進行不同添加水平（樣品1：5mg/100g，10mg/100g；樣品2：10mg/100g）測定，結(jié)果見表3（每個結(jié)果均為6次平行測定的均值）。

表3 2種方法對實際樣品中肌醇含量的測定結(jié)果（mg/100g）

表3顯示，采用國標法測定樣品中肌醇含量，回收率為99-100%，各次重復測定標準差<5%；而本方法測定結(jié)果準確性和重現(xiàn)性好，平均回收率為95%-98%，各次重復測定標準差也<5%，與國標法相比，沒有顯著性差異。

基于本方法能夠除掉樣品中大部分雜質(zhì)，減少雜質(zhì)峰的干擾以及對儀器的損傷，因此可采用本方法測定嬰幼兒配方奶粉中的肌醇含量。

4 結(jié)論

本研究采用LC-Florisil 固相萃取小柱對試樣進行凈化處理，濃縮，經(jīng)硅烷化試劑衍生，處理好的試樣供氣相色譜儀（帶FID檢測器）進行測定。結(jié)果顯示，本方法能夠除掉樣品中大部分的雜質(zhì)，色譜雜峰較少，受樣品基質(zhì)影響小，樣品檢測結(jié)果回收率在95%-98%，且各次重復測定標準差<5%，可以滿足奶粉樣品中肌醇含量的準確測定；分別采用國標法和本方法對樣品中肌醇含量進行測定，結(jié)果顯示兩種方法無顯著性差異。

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