·論著·

中心組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化載基因殼聚糖納米粒的最佳轉(zhuǎn)染制備區(qū)域

目的采用中心組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化載基因殼聚糖納米粒的最佳轉(zhuǎn)染制備區(qū)域。方法采用復(fù)凝聚法制備載質(zhì)?；虻臍ぞ厶羌{米粒，選擇殼聚糖濃度和質(zhì)?；驖舛茸鳛閷?shí)驗(yàn)考察因素，應(yīng)用兩因素五水平中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)染制備區(qū)域，優(yōu)化指標(biāo)選擇平均粒徑和基因轉(zhuǎn)染率。通過透射電鏡觀察納米粒的形態(tài);通過動(dòng)態(tài)光散射和電泳光散射技術(shù)分別測(cè)量納米粒的粒徑和Zeta電位;通過凝膠電泳分析考察質(zhì)粒在納米粒制備過程中的穩(wěn)定性;通過倒置熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá);通過流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定納米粒的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果 成功優(yōu)化了載基因殼聚糖納米粒的最佳轉(zhuǎn)染制備區(qū)域。優(yōu)選條件下制備的納米粒大多呈球形，納米粒平均粒徑為217.6 nm，粒徑多分散系數(shù)為0.241，表明粒徑分布較窄。納米粒zeta電位為+22.4mV，表明納米粒表面帶有正電荷，可以增加納米粒混懸液的穩(wěn)定性。凝膠電泳分析結(jié)果表明質(zhì)粒基因在納米粒制備過程中沒有遭到破壞。納米粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比較高，能夠高效地將綠色熒光蛋白質(zhì)?；蜻f送到細(xì)胞內(nèi)，并且基因表達(dá)產(chǎn)生綠色熒光蛋白。結(jié)論本研究建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性。在優(yōu)化的制備區(qū)域內(nèi)制備的載基因殼聚糖納米粒的轉(zhuǎn)染性能比較理想。

納米粒;質(zhì)?；?中心組合設(shè)計(jì);殼聚糖;轉(zhuǎn)染效率

基因治療是一種富有前景的疾病治療方法。目前制備納米?；蜻f送系統(tǒng)選用的材料主要有殼聚糖［1-5］、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)［6］和明膠［7］等，制備工藝主要有凝聚法［1-5，7］和乳化揮發(fā)法［6］等。殼聚糖(chitosan)是甲殼素N-脫乙?；难苌?，是一種生物可降解多糖，具有良好的組織相容性。殼聚糖高分子鏈上有許多游離氨基，在酸性條件下游離氨基可以發(fā)生質(zhì)子化而使殼聚糖分子帶正電荷，而質(zhì)?；蚍肿渔溕嫌泻芏嗔姿峄鶊F(tuán)，其分子上的H+解離導(dǎo)致DNA分子鏈帶負(fù)電荷，DNA和殼聚糖分子混合后通過靜電絡(luò)合，兩者壓縮在一起形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物或納米粒等［8，9］。利用這一特點(diǎn)，可以使用復(fù)凝聚法制備載基因殼聚糖納米粒［1-5］。該方法較乳化揮發(fā)法制備工藝簡(jiǎn)單，不使用有機(jī)溶劑，制備條件溫和，也不會(huì)破壞質(zhì)粒基因的結(jié)構(gòu)和功能［10］。

由于基因遞送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染能力從根本上反映基因遞送系統(tǒng)的效率，所以大都采用基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)基因遞送系統(tǒng)的性能。在基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中多采用綠色熒光蛋白(pEGFP)、螢火蟲熒光素酶等報(bào)告基因來評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染性能，因?yàn)檫@些基因的表達(dá)產(chǎn)物易于檢測(cè)。中心組合設(shè)計(jì)(central composite design，CCD)是近年來國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較多的一種優(yōu)化方法，可用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)相關(guān)系數(shù)較高，模型預(yù)測(cè)性比較好［11，12］。

過去眾多學(xué)者研究制備了載基因殼聚糖納米粒，但是還未見對(duì)最佳轉(zhuǎn)染制備區(qū)域進(jìn)行優(yōu)化的報(bào)道。在前期研究基礎(chǔ)上，本研究選擇綠色熒光蛋白質(zhì)粒報(bào)告基因?yàn)槟Ｐ突蛩幬?，通過復(fù)凝聚法制備載基因殼聚糖納米粒，采用CCD設(shè)計(jì)比較系統(tǒng)地優(yōu)化殼聚糖納米粒基因遞送系統(tǒng)的最佳轉(zhuǎn)染制備區(qū)域，并系統(tǒng)考察載基因殼聚糖納米粒的基本理化性質(zhì)，為研究者制備和拓展使用載基因殼聚糖納米粒提供方法借鑒和技術(shù)參考，推動(dòng)載基因殼聚糖納米粒的應(yīng)用和發(fā)展。

1 材料與儀器

1.1 材料PROTASANTMCL 113殼聚糖(Pronova Biomedical，Norway，MW 110 000，脫乙酰度87%); DMEM培養(yǎng)基(GIBCO BRL?，USA);Lipofectamine脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(GIBCO BRL?，USA);pEGFP綠色熒光蛋白質(zhì)粒基因(clontech，實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增和提取);HEK293人胚胎腎細(xì)胞(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供);各種細(xì)胞培養(yǎng)用試劑;其他試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水。

1.2 儀器CM120透射電子顯微鏡(Pillips，Netherlands);QL-901旋渦混合器(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠);Finnpipette移液器(Labsystems，F(xiàn)inland); Zetasizer 3000HS納米粒度分析儀(Malvern Instruments，UK);IX70倒置熒光顯微鏡(Olympus，Japan);CO2恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo，Japan);TLL-C臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠);普通光學(xué)顯微鏡(Olympus，Japan);超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 載基因殼聚糖納米粒的制備采用復(fù)凝聚法制備載基因殼聚糖納米粒。將一定濃度的殼聚糖溶液和200μl一定濃度的綠色熒光蛋白質(zhì)?；蛉芤悍謩e置于55℃水浴恒溫20 min。精密吸取殼聚糖溶液200μl加到質(zhì)粒基因溶液中，迅速在旋渦混合器上混合30 s，即得載基因殼聚糖納米粒混懸液。

2.2 納米粒形態(tài)、粒徑與Zeta電位的測(cè)定吸取少量納米?；鞈乙旱沃龄佊刑寄さ你~網(wǎng)上，靜置2 min，用濾紙吸干混懸液，再滴加2%(W/V)磷鎢酸染色，晾干后，于透射電子顯微鏡下觀察納米粒形態(tài)。另取納米?；鞈乙哼m量，通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和電泳光散射(ELS)技術(shù)，使用馬爾文納米粒度及zeta電位分析儀測(cè)定平均粒徑、多分散系數(shù)及其zeta電位。

2.3 基因轉(zhuǎn)染將HEK293細(xì)胞按3×104/孔分別接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，設(shè)立樣品孔、陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔。將200 μl納米?；鞈乙轰伡拥綐悠房字?，每個(gè)樣品平行做3孔;同時(shí)，將200μl脂質(zhì)體-pDNA復(fù)合物加到陽性對(duì)照孔中;陰性對(duì)照孔不加納米粒或只加裸質(zhì)?；颉７跤? h后吸去轉(zhuǎn)染物，加入1ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔48 h換加1ml新鮮培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染24 h后，用倒置熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定時(shí)觀察。

2.4 基因轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定在設(shè)定時(shí)間吸棄孔中舊培養(yǎng)基，用PBS洗一遍，加入0.25%胰蛋白酶消化液，室溫放置3～5min。向孔中加入PBS，制備單個(gè)細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液于1 200 r/min離心10 min，棄去PBS，加入2%多聚甲醛固定液0.5 ml，將細(xì)胞沉淀吹打散開再制成細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。

2.5 處方優(yōu)化

2.5.1 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)納米粒制備和性質(zhì)影響較顯著的2個(gè)因素:殼聚糖濃度(X1)和質(zhì)?；驖舛?X2)作為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素，并確定2個(gè)因素的考察范圍。根據(jù)CCD設(shè)計(jì)原理，每個(gè)因素設(shè)5個(gè)水平考察，各因素及水平見表1，實(shí)驗(yàn)安排見表2。各處方點(diǎn)的考察指標(biāo)平均粒徑和基因轉(zhuǎn)染效率測(cè)定結(jié)果見表3。

表1 各因素水平代碼及實(shí)驗(yàn)操作值

表2 實(shí)驗(yàn)安排(n=2)

表3 考察指標(biāo)平均粒徑和基因轉(zhuǎn)染效率測(cè)定結(jié)果

2.5.2 模型擬合以平均粒徑和基因轉(zhuǎn)染率作為指標(biāo)(因變量)，分別對(duì)各因素(自變量)進(jìn)行多元線性回歸和多元非線性回歸擬合。模型如下:

多元線性回歸:Y=B0+B1X1+B2X2

對(duì)擬合方程進(jìn)行方差分析，舍去P＞0.05的各擬合項(xiàng)，再進(jìn)行擬合，求得簡(jiǎn)化方程。根據(jù)擬合的回歸方程繪制各指標(biāo)隨自變量變化的三維效應(yīng)面(response surface)，由效應(yīng)面選取優(yōu)化工藝條件，按優(yōu)化的工藝條件制備基因殼聚糖納米粒，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

擬合多元線性回歸方程如下:

以上結(jié)果表明:平均粒徑各因素呈良好的線性關(guān)系，線性檢驗(yàn)F值均較大，P值＜0.05，表明有顯著性差異;而基因轉(zhuǎn)染率多元線性回歸方程相關(guān)性均不好，P值＞0.05，表明線性關(guān)系不顯著。

多元非線性回歸二項(xiàng)式擬合結(jié)果如下:

以方程的回歸系數(shù)r最大且P最小為原則，結(jié)果表明多元非線性回歸二項(xiàng)式擬合效果最好。

2.5.3 效應(yīng)面優(yōu)化根據(jù)上述優(yōu)化的各指標(biāo)(因變量)多元非線性回歸二項(xiàng)式擬合方程，使用Origin統(tǒng)計(jì)軟件繪制了因變量隨自變量變化的效應(yīng)面圖(圖1、2)。從各指標(biāo)的因變量效應(yīng)面上優(yōu)選出較佳的制備區(qū)域(表4)，并綜合分析得出公共優(yōu)化區(qū)域:X1為0.40～0.55 mg/ml，X2為0.11～0.14 mg/ml。

表4 因變量效應(yīng)面上最佳制備區(qū)域

各因變量隨自變量X1和X2變化的三維效應(yīng)面及相應(yīng)等高線圖如下:

圖1 平均粒徑效應(yīng)面和對(duì)應(yīng)的等高線圖

圖2 基因轉(zhuǎn)染效率效應(yīng)面和對(duì)應(yīng)的等高線圖

在優(yōu)選區(qū)域內(nèi)選取較優(yōu)條件(X1=0.45mg/ml，X2=0.12 mg/ml)制備基因殼聚糖納米粒，測(cè)定了平均粒徑和基因轉(zhuǎn)染效率，然后與模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，以上各指標(biāo)的偏差分別為0.64%和-5.01%(表5)，表明各因變量的預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值的偏差均較小，證明本研究所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，可用來預(yù)測(cè)載基因殼聚糖納米粒的平均粒徑和基因轉(zhuǎn)染效率。

表5 預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較

2.6 質(zhì)?；蛟诩{米粒制備過程中的穩(wěn)定性在不加入殼聚糖的情況下，將經(jīng)過不同制備工藝參數(shù)處理的質(zhì)?；蜻M(jìn)行0.8%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，同未經(jīng)處理的質(zhì)粒對(duì)照比較，觀察質(zhì)粒電泳條帶的變化，考察質(zhì)粒基因在各種制備條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明(圖3)，質(zhì)?；蛟诓煌に噮?shù)條件下的電泳條帶和對(duì)照質(zhì)粒相比都幾乎沒有變化，說明質(zhì)?；蛟诩{米粒制備過程中沒有遭到破壞，不僅證明了復(fù)凝聚法制備載基因殼聚糖納米粒的工藝合理性，也為質(zhì)?；虮患{米粒遞送進(jìn)入細(xì)胞后保持基因表達(dá)活性提供了保障。

圖3 不同制備工藝參數(shù)條件對(duì)質(zhì)粒基因穩(wěn)定性的影響

A.λ-EcoT14Ⅰ相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)照;B.未處理質(zhì)粒(對(duì)照);C.未加Na2SO4，渦旋混合，室溫;D.未加Na2SO4，渦旋混合，55℃;E.加Na2SO4，未渦旋混合，室溫;F.加Na2SO4，渦旋混合，室溫;G.加Na2SO4，渦旋混合，55℃;H.加Na2SO4，未渦旋混合，55℃

2.7 優(yōu)化條件下納米粒的形態(tài)、粒徑及分布通過透射電鏡觀察結(jié)果表明，優(yōu)選條件下制備的載基因殼聚糖納米粒呈現(xiàn)良好的分散狀態(tài)，形態(tài)比較規(guī)則，大多呈球形(圖4)。經(jīng)納米粒度分析測(cè)定，結(jié)果表明，納米粒平均粒徑為217.6 nm，粒徑多分散系數(shù)為0.241，表明粒徑分布較窄，納米粒大小比較均勻。

圖4 載基因殼聚糖納米粒透射電鏡圖(×22 000)

2.8 載基因殼聚糖納米粒表面的zeta電位納米粒子表面的電荷性質(zhì)對(duì)于納米制劑的體系穩(wěn)定性至關(guān)重要。本研究對(duì)中心組合設(shè)計(jì)不同實(shí)驗(yàn)點(diǎn)制備的載基因殼聚糖納米粒的zeta電位進(jìn)行測(cè)定。其中，5號(hào)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)由于納米粒制備后發(fā)生團(tuán)聚沉淀而未做測(cè)定。結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)制備的納米粒表面都帶有一定強(qiáng)度的正電荷(表6)，這使得納米粒憑借同種電荷相互排斥作用而不易聚集，可增加納米?；鞈乙旱捏w系穩(wěn)定性。另外，通過中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)選條件制備的納米粒zeta電位測(cè)定結(jié)果為+22.4mV(圖5)。

圖5 載基因殼聚糖納米粒Zeta電位分布

表6 中心組合設(shè)計(jì)不同實(shí)驗(yàn)點(diǎn)制備的載基因殼聚糖納米粒的zeta電位

2.9 倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果使用優(yōu)選條件制備的載基因納米粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。通過倒置熒光顯微鏡進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，轉(zhuǎn)染第1天后發(fā)現(xiàn)在納米粒組能夠觀察到零星的綠色熒光點(diǎn)，而在陰性對(duì)照組和裸質(zhì)粒組卻觀察不到，說明在納米粒組細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光蛋白表達(dá)生成，證明殼聚糖納米粒能夠?qū)⒕G色熒光蛋白質(zhì)?；蜻f送到了細(xì)胞內(nèi)，并且基因表達(dá)產(chǎn)生了綠色熒光蛋白。圖6是第3天的基因轉(zhuǎn)染效果照片，可以看出在較優(yōu)條件下制備的載pEGFP質(zhì)?；驓ぞ厶羌{米粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率很高，表達(dá)效果比較理想。

圖6 載pEGFP基因殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞后綠色熒光蛋白的表達(dá)(A.×100;B.×200)

3 討論

制劑工藝優(yōu)化普遍采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，數(shù)據(jù)處理較為方便。但上述方法均為基于線性模型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如果因素與效應(yīng)間為非線性關(guān)系，特別是各因素間存在相互作用時(shí)，那么得出的最優(yōu)工藝可能與實(shí)際情況存在較大偏離。目前，中心組合設(shè)計(jì)在制劑工藝優(yōu)化中被廣泛采用，該設(shè)計(jì)充分考慮了因素與效應(yīng)間的非線性可能和各因素間的交互作用，可克服正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)精度低、預(yù)測(cè)性差等不足。中心組合設(shè)計(jì)法優(yōu)化制劑處方工藝，方法簡(jiǎn)便，可對(duì)多因素和多指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行綜合優(yōu)化篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)較為準(zhǔn)確。因此，中心組合設(shè)計(jì)是進(jìn)行多因素及多指標(biāo)處方和制備工藝優(yōu)化篩選的較佳方法。

在一些發(fā)表的論文中，有研究者使用N/P比作為影響因素來考察材料與基因的比例對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。N/P比的定義是基因載體中能夠質(zhì)子化的氨基的摩爾數(shù)與基因中能夠解離的磷酸根的摩爾數(shù)的比值。首先，從定義來看，N/P比這個(gè)概念只適用于含有氨基的聚陽離子基因載體，覆蓋面顯得有點(diǎn)窄，因?yàn)橛械幕蜻f送載體本身不含氨基，例如PLGA。其次，N/P比的數(shù)值不是很準(zhǔn)確，一方面，因?yàn)榫酆衔锉旧聿皇欠肿恿烤坏奈镔|(zhì)，其分子量有一個(gè)分布，在計(jì)算載體的氨基摩爾數(shù)時(shí)只能使用聚合物平均分子量這個(gè)指標(biāo)，這樣得出的氨基摩爾數(shù)可以說并不十分精確;另一方面，組成基因(DNA)的4種脫氧核糖核苷酸(每個(gè)核苷酸含有一分子磷酸)的分子量不同，相互間略有差別，在計(jì)算解離磷酸根摩爾數(shù)時(shí)只能使用核苷酸平均分子量這個(gè)指標(biāo)，由此得出的磷酸根摩爾數(shù)也不精確，進(jìn)而導(dǎo)致最終計(jì)算的N/P比的數(shù)值不精確。所以，本研究沒有使用N/P比作為指標(biāo)因素來考察材料與基因的比例對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)在中心組合設(shè)計(jì)中質(zhì)量比(也可理解為N/P比)較高的處方點(diǎn)(例如3、6、7)對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染效率反而較低(表3)。為了解釋該現(xiàn)象，本研究對(duì)中心組合設(shè)計(jì)不同實(shí)驗(yàn)點(diǎn)制備的載基因殼聚糖納米粒的zeta電位進(jìn)行了測(cè)定(表6)。結(jié)果表明，質(zhì)量比較高的處方點(diǎn)(例如3、6、7)對(duì)應(yīng)的zeta電位較低。眾所周知，細(xì)胞膜表面帶有一定密度負(fù)電荷，這樣表面帶有正電荷的納米粒子可以通過電性作用黏附于細(xì)胞膜表面，有利于荷正電納米粒的細(xì)胞攝取。因此可以推斷:對(duì)于上述質(zhì)量比較高的處方點(diǎn)制備的納米粒，其具有較低的zeta電位，在一定程度上降低了納米粒和細(xì)胞膜的黏附效率，減少了納米粒入胞數(shù)量，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率較低。

綜上所述，本研究采用復(fù)凝聚法制備載pEGFP質(zhì)?；虻臍ぞ厶羌{米粒，并采用中心組合設(shè)計(jì)成功對(duì)載基因殼聚糖納米?；蜻f送系統(tǒng)的最佳轉(zhuǎn)染制備區(qū)域進(jìn)行了優(yōu)化，建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性。本研究在優(yōu)化條件下制備的基因殼聚糖納米粒大多呈球形，粒徑大小分布均勻，納米粒的轉(zhuǎn)染性能比較理想。殼聚糖本身沒有細(xì)胞毒性，其在體內(nèi)可生物降解，具有良好的組織相容性，殼聚糖納米粒用作基因遞送載體是安全的。雖然優(yōu)化的轉(zhuǎn)染效率仍然比不上一些商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑(如Lipofectamine 2000)，但是殼聚糖納米粒在體內(nèi)應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(例如口服基因遞送效果理想［5］)，是一種很有前景的體內(nèi)基因遞送載體。筆者旨在為研究者制備和拓展應(yīng)用載基因殼聚糖納米粒提供一定參考和借鑒。

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Optimized preparation of DNA-chitosan nanoparticles with high transfection efficency through a central com position design

SHAO Shuai1，4，CUIGuanghua2，ZHOU Xu3，GAO Zhonggao1，HUANGWei1(1.Department of Pharmaceutics，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100050，China;2.Department of Pharmaceutics，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China;3.302Military Hospital of China，Beijing 100039，China;4.Department of Pharmaceutics，Yanbian University，Yanji133000，China)

Objective This study aimed to optimize the preparation condition of DNA-chitosan nanoparticleswith high transfection efficency through a central composition design.Methods The DNA-chitosan nanoparticleswere prepared by complex coacervation between pEGFP and chitosan.We selected the concentrations of chitosan and plasmid as two experimental factors，and a central composite design with two factors and five levelswas used to optimize the preparation condition of DNA-chitosan nanoparticles for high transfection efficency.The concentrations of chitosan and plasmid were selected as the independent variables，respectively.The dependent variables included average particle size and transfection efficiency.Themorphology of DNA-chitosan nanoparticles was observed using a transmission electronmicroscope.The size and zeta potential of nanoparticlesweremeasured by dynamic light scattering(DLS)and electrophoretic light scattering(ELS)，respectively.The stability of plasmids in the process of nanoparticles preparation was investigated through the agrose gel electrophoresis.The expression of plasmids delivered by nanoparticleswas observed under an inverted fluorescencemicroscope. The transfection efficiency of DNA-chitosan nanoparticleswas assayed by flow cytometry.ResultsThe preparation condition of DNA-chitosan nanoparticleswith high transfection efficency was optimized successfully.Under the optimum preparative conditions，the DNA-chitosan nanoparticles were almost spherical.The average size of nanoparticles was 217.6nm，and distributed in a narrow range with a polydispersity index of0.241.The zeta potentialwas+22.4mV，which suggested thata den-sity of positive charge existonto the surface of nanoparticles and consequently enhanced the stability of nanoparticles suspension.The results ofgelelectrophoresis showed thatplasmidswere not destroyed in the process of nanoparticles preparation.The cell transfection of nanoparticleswas very highly efficient.Thenanoparticles could effectively deliver the pEGFP plasmids into cells to express the green fluorescent protein ata high level. Conclusion邵帥1，4，崔光華2，周旭3，高鐘鎬1，黃偉1(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥物制劑研究室，北京 100050;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所藥物制劑研究室，北京 100850;3.中國(guó)人民解放軍302醫(yī)院，北京 100039;4.延邊大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室，吉林延吉 133000)The established mathematic models have the good predictive function.Under the optimum preparative conditions，the DNA-chitosan nanoparticles have the high potential of cell transfection.

nanoparticles;plasmid DNA;central composition design;chitosan;transfection efficency

Q343 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A ［文章編號(hào)］1006-0111(2014)06-0419-06

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.006

2013-12-15

2014-06-13

［本文編輯］李睿旻

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(7142114);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金(2014ZD02);協(xié)和青年科研基金(2012G07).

邵帥，碩士研究生.Tel:(010)63026505，E-mail:shaohuai1481@126.com.

黃偉，副研究員，碩士研究生導(dǎo)師.Tel:(010)63026505，E-mail:huangwei@imm.ac.cn.