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        用在體皮膚微透析法研究黃芩苷凝膠經(jīng)大鼠皮膚吸收的局部藥動(dòng)學(xué)

        2014-05-25 00:33:28婁月芬朱全剛尤本明李潔顧小燕張若曦上海市第一人民醫(yī)院分院藥劑科上海0008上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部上海0047第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部上海004
        藥學(xué)實(shí)踐雜志 2014年6期
        關(guān)鍵詞:藥動(dòng)學(xué)透析液黃芩

        婁月芬,朱全剛,尤本明,李潔,顧小燕,張若曦(.上海市第一人民醫(yī)院分院藥劑科,上海 0008;.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部,上海 0047;.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部,上海 004)

        ·論著·

        用在體皮膚微透析法研究黃芩苷凝膠經(jīng)大鼠皮膚吸收的局部藥動(dòng)學(xué)

        婁月芬1,朱全剛2,3,尤本明3,李潔3,顧小燕2,張若曦2(1.上海市第一人民醫(yī)院分院藥劑科,上海 200081;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部,上海 200437;3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部,上海 200433)

        目的建立大鼠在體皮膚微透析技術(shù),研究黃芩苷凝膠經(jīng)皮吸收局部藥動(dòng)學(xué)。方法采用HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定大鼠皮膚微透析液中黃芩苷的濃度。SD大鼠在麻醉狀態(tài)下做皮膚微透析預(yù)處理,然后將黃芩苷凝膠涂于探針?biāo)谄つw表面,收集皮膚微透析液樣品進(jìn)行黃芩苷濃度測(cè)定,繪制黃芩苷濃度-時(shí)間曲線,計(jì)算經(jīng)皮吸收局部藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果用于定量分析的離子對(duì)為m/z447.3→271.2,黃芩苷在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,色譜的專屬性、精密度等測(cè)定結(jié)果均符合生物樣品測(cè)定要求。體內(nèi)皮下探針對(duì)黃芩苷的回收率為(24.40±0.91)%,240 min內(nèi)各取樣點(diǎn)回收率保持穩(wěn)定;黃芩苷經(jīng)皮給藥后8 h內(nèi)微透析液中均可檢測(cè)到黃芩苷的存在,且藥物在皮膚組織內(nèi)濃度持續(xù)升高,AUC0-t為(50.04±34.17)(mg·min)/L。結(jié)論

        黃芩苷凝膠;微透析;經(jīng)皮吸收局部藥動(dòng)學(xué);大鼠

        三黃膏是目前臨床常用于瘡瘍初起、紅腫熱痛及輕度燙傷等癥的外用復(fù)方中藥制劑,由黃柏、黃芩、黃連及梔子與適宜基質(zhì)組成,具有清熱解毒、消腫止痛之功效。其中,黃芩是一味非常重要的中藥,其主要成分黃芩苷具有良好的抗炎、抗菌、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)等藥理活性[1]。在體皮膚微透析技術(shù)可以對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人體皮膚組織進(jìn)行在體、連續(xù)的藥物濃度測(cè)定,現(xiàn)已廣泛用于外用制劑的在體經(jīng)皮吸收動(dòng)力學(xué)研究[2]。為進(jìn)一步研究三黃膏經(jīng)皮給藥的體內(nèi)過程,本研究將其主要活性成分黃芩苷制成外用凝膠,用在體皮膚微透析法研究黃芩苷經(jīng)大鼠皮膚吸收的局部藥動(dòng)學(xué)。

        1 材料

        1.1 藥物和試劑黃芩苷對(duì)照品(純度98%,中國藥品生物制品檢定所,批號(hào)110715-201016);甲醇(色譜純,美國Merck公司);蒸餾水(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院藥學(xué)部);Veet脫毛膏(法國Veet公司);其他試劑均為分析純。

        1.2 儀器W201型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司);PHS-3TC精密酸度計(jì)(上海天達(dá)儀器有限公司);DSHZ300多用途恒溫水浴振蕩器(江蘇省太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);FA-2004萬分之一電子天平(上海天平儀器廠);十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)。MD1001灌注器推進(jìn)泵、MD-1020-K四聯(lián)流量控制器和容量為1 ml的灌注器(美國BAS公司);線性探針(膜長30 cm)。90-1型磁力攪拌器(上海振榮科學(xué)儀器有限公司)。G 6410A HPLCMS/MS聯(lián)用儀(配有三重四級(jí)桿LC-MS系統(tǒng)、G1311四元泵、G1322真空泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器和G1316A柱溫箱,美國安捷倫公司)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠,體重約200 g,由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(滬)2007-0003。

        2 方法和結(jié)果

        2.1 色譜條件XTerraR MS C18色譜柱(2.1mm× 150 mm,5μm,美國Waters公司);流動(dòng)相:甲醇∶水(含2 mmol/L甲酸銨,用甲酸調(diào)節(jié)pH至3.5)= 85∶15;流速:0.4 ml/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:1μl。

        圖1 黃芩苷的的總離子流色譜圖

        2.2 質(zhì)譜條件離子源為電噴霧電離源(ESI),正離子掃描方式及多離子反應(yīng)方式(MRM)檢測(cè);干燥氣(N2)溫度為350℃,流速為10 L/min;毛細(xì)管電壓為4 000 V;霧化壓力為40 psi,裂解電壓為122 V;檢測(cè)時(shí)間3 min。在一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中獲得黃芩苷的準(zhǔn)分子離子峰為m/z447.3,選擇性對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,得到主要碎片離子為m/z 271.2,儀器自動(dòng)優(yōu)化相對(duì)碰撞能量為21 eV。將上述離子對(duì)用于定量分析。

        2.3 微透析介質(zhì)的配制分別稱取無水枸櫞酸0.73 g,二水枸櫞酸鈉2.2 g,無水葡萄糖2.45 g,依地酸二鈉0.4 g,半胱氨酸0.2 g,溶解于蒸餾水中,定容至1 000 ml,用0.45μm的水系微孔濾膜過濾,即得微透析介質(zhì)(pH 3.95)。

        圖2 黃芩苷的質(zhì)譜圖

        2.4 系列濃度對(duì)照品溶液的配制精密稱取適量黃芩苷對(duì)照品置于100 ml容量瓶中,用微透析介質(zhì)溶解并稀釋至刻度,配制成10μg/ml的黃芩苷儲(chǔ)備液。依次精密量取該儲(chǔ)備液適量,置于10 ml容量瓶中,用微透析介質(zhì)稀釋至刻度,搖勻,配制成2、5、10、20、50、100、200 ng/ml的系列濃度對(duì)照品溶液。

        2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及方法學(xué)考察

        2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取系列濃度對(duì)照品溶液各1μl,分別進(jìn)樣測(cè)定,以黃芩苷對(duì)照品的峰面積Y對(duì)相應(yīng)的濃度X(ng/ml)進(jìn)行線性回歸,得微透析樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=14.11X-8.85(r =0.999 7),線性范圍為2~200 ng/ml。

        2.5.2 方法專屬性分別取大鼠腹部皮膚給予空白凝膠2 h、黃芩苷凝膠2 h后的皮下微透析樣品進(jìn)行HPLC-MS/MS分析,結(jié)果表明,空白凝膠給藥后皮下微透析樣品未見待測(cè)物本底以及其他干擾物質(zhì)影響黃芩苷的測(cè)定。

        2.5.3 精密度試驗(yàn)分別量取低(2ng/ml)、中(20 ng/ml)、高(200 ng/ml)3種濃度的對(duì)照品溶液,在1 d內(nèi)測(cè)定黃芩苷濃度5次,得日內(nèi)RSD分別為2.22%、0.26%、0.28%(n=5);連續(xù)進(jìn)樣3 d,得日間RSD分別為3.17%、1.20%、2.08%(n=5),表明精密度良好。

        2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)采用微透析介質(zhì)分別配制低(1μg/ml)、中(4μg/ml)、高(10μg/ml)3種濃度的對(duì)照品溶液,置于37℃水浴中加熱24 h,適當(dāng)稀釋后進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果分別相當(dāng)于配制濃度的103.88%、97.39%、97.98%,表明黃芩苷在透析及樣品測(cè)定過程中穩(wěn)定性好。

        2.6 黃芩苷凝膠處方及制作方法

        2.6.1 處方黃芩苷2 g,羥丙甲纖維素(HPMC E3-2V)10 g,聚乙二醇400(PEG 400)5 g,甘油20g,氮酮5 g,無水枸櫞酸0.073 g,二水枸櫞酸鈉0.22 g,蒸餾水加至總量100 g。

        2.6.2 制作方法取無水枸櫞酸、二水枸櫞酸鈉溶于適量蒸餾水中,加入羥丙甲纖維素溶脹,備用;另取聚乙二醇、甘油、氮酮,加入黃芩苷,充分?jǐn)嚢杌靹虻命S芩苷溶液,將此加入前述羥丙甲纖維素溶液,用蒸餾水補(bǔ)足至100 g,攪勻,即得凝膠。

        2.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理取SD大鼠,體重約200 g,實(shí)驗(yàn)前1 d用脫毛膏去除腹部毛。實(shí)驗(yàn)前用25%烏拉坦溶液3 ml/kg腹腔注射麻醉動(dòng)物,將大鼠腹部朝上固定于保溫墊上,使其體溫維持在37.5℃左右。將2根線性微透析探針(膜長30mm,截留相對(duì)分子質(zhì)量5 000)用18G穿刺針引導(dǎo)平行植入皮下后(間隔2 cm),引導(dǎo)針抽回而微透析探針膜管留于大鼠皮下組織中,將探針連接于微透析裝置。

        2.8 大鼠體內(nèi)黃芩苷回收率測(cè)定以微透析介質(zhì)配制濃度為4μg/ml(Cperf)的黃芩苷灌流液,2只SD大鼠分別植入2根探針,灌注速度3μl/min,平衡90 min后,每20 min收集一次透析液,各收集12個(gè)樣品,用HPLC-MS/MS測(cè)定藥物濃度(Cdial)。根據(jù)公式[2]Rdial=(Cperf-Cdial)/Cperf計(jì)算黃芩苷的體內(nèi)回收率為(24.40±0.91)%(n=4),240 min內(nèi)各取樣點(diǎn)回收率保持穩(wěn)定。

        2.9 黃芩苷凝膠經(jīng)皮吸收局部的藥動(dòng)學(xué)過程采用4只SD大鼠建立微透析系統(tǒng),每只大鼠植入2根探針,用不含藥物的微透析介質(zhì)灌注探針90 min后,在透析窗正上方局部皮膚用2%黃芩苷凝膠1 g包封,平衡40min后,每隔20min收集1次透析液,收集8 h,用HPLC-MS/MS測(cè)定藥物濃度(Cdial),所測(cè)濃度經(jīng)回收率校正后即為皮下組織中藥物濃度(Ctiss=Cdial/Rdial)。該凝膠經(jīng)皮給藥后40 min至8 h內(nèi)微透析液中均可檢測(cè)到黃芩苷的存在,且藥物在皮膚組織內(nèi)濃度持續(xù)升高,AUC0-t為(50.04±34.17)(mg·min)/L。

        圖3 黃芩苷凝膠給藥的大鼠皮膚藥物濃度-時(shí)間曲線(n=8)

        3 討論

        在體皮膚微透析樣品體積小,所含藥物濃度低,因此對(duì)分析方法的靈敏度要求很高。HPLC-MS/MS法具有高效、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),因而廣泛應(yīng)用于在體皮膚微透析樣品的分析。探針植入皮下所造成的創(chuàng)傷十分輕微,但亦可產(chǎn)生紅斑、引起組織中小分子物質(zhì)濃度和組織血液灌流量的改變,從而影響研究結(jié)果。因此在探針植入后到局部給藥前需有一段平衡時(shí)間,通常為60~90 min[2]。

        在微透析取樣方法中,探針回收率的準(zhǔn)確校正是獲得組織液內(nèi)真實(shí)藥物濃度的關(guān)鍵。李潔等[3]在前期研究中已采用微透析聯(lián)用HPLC法測(cè)定透析液中黃芩苷的濃度,結(jié)果表明,隨著流速增加,回收率降低,并且增量法和減量法測(cè)得的回收率隨流速的變化趨勢(shì)相對(duì)一致。用不同濃度的灌流液,黃芩苷回收率差異很小,表明灌流液濃度對(duì)黃芩苷的回收率幾乎沒有影響。在灌流液速度相同的實(shí)驗(yàn)條件下,增量法和減量法測(cè)定結(jié)果比較一致,即黃芩苷通過微透析膜不存在擴(kuò)散方向依賴性。因此,本研究將微透析技術(shù)應(yīng)用到黃芩苷的皮膚藥動(dòng)學(xué)研究時(shí),采用減量法測(cè)定黃芩苷的體內(nèi)探針回收率。

        黃芩苷的穩(wěn)定性受溫度、pH值等多種因素影響,其穩(wěn)定pH值范圍為3~4[4]。本研究未采用李潔等研究中選擇的PBS(pH 5.5)作為體內(nèi)微透析的灌流介質(zhì)。究其原因,在體內(nèi)探針回收率研究過程中發(fā)現(xiàn),在pH 5.5條件下,由于SD大鼠皮下生理?xiàng)l件的影響,微透析液中黃芩苷濃度很低,難以準(zhǔn)確檢測(cè)。在參考有關(guān)文獻(xiàn)[5]的基礎(chǔ)上,采用改良的枸櫞酸葡萄糖抗凝溶液(anticoagulant citrate dextrose)作為微透析介質(zhì),內(nèi)含有3.5 mmol/L枸櫞酸、7.5 mmol/L枸櫞酸鈉、136.0 mmol/L葡萄糖及抗氧化劑0.02%半胱氨酸和0.04%依地酸二鈉,此溶液中黃芩苷的穩(wěn)定性滿足分析要求,且在大鼠體內(nèi)的探針回收率亦穩(wěn)定。

        從黃芩苷凝膠經(jīng)皮給藥局部藥動(dòng)學(xué)過程可以看出,黃芩苷能夠較迅速透過皮膚,在實(shí)驗(yàn)的8 h內(nèi)濃度持續(xù)增加,尚未達(dá)到最高濃度,下一步的研究中將延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),黃芩苷凝膠的皮下濃度在各個(gè)探針和大鼠之間存在差異,其原因可能是各大鼠對(duì)藥物的皮膚屏障作用以及皮膚代謝作用不一致,而非微透析技術(shù)自身缺陷所造成的。本研究成功建立了HPLC-MS/MS法檢測(cè)大鼠皮下微透析樣品中黃芩苷的含量,并考察了黃芩苷凝膠給藥后皮膚局部組織的藥動(dòng)學(xué)過程,表明在體皮膚微透析法可用于黃芩苷經(jīng)皮吸收局部藥動(dòng)學(xué)研究。

        【參考文獻(xiàn)】

        [1]王雷,王學(xué)艷,周雪琴,等.黃芩苷凝膠設(shè)計(jì)與體外透皮性能的研究[J].中草藥,2008,39(10):1502-1504.

        [2]陳芳,胡晉紅,朱全剛.用微透析法測(cè)定氫溴酸東茛菪堿凝膠經(jīng)皮給藥大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究[J].藥學(xué)服務(wù)與研究,2012,12(4):270-273.

        [3]李潔,朱全剛,尤本明,等.采用微透析聯(lián)用HPLC法測(cè)定透析液中黃芩苷的濃度[J].藥學(xué)服務(wù)與研究,2012,12(1): 73-74.

        [4]Xing J,Chen X,Zhong D.Stability of baicalin in biological fluids in vitro[J].J Pharm Biomed Anal,2005,39(3-4):593-600.

        [5]Huang H,Zhang Y,Yang R,et al.Determination of baicalin in rat cerebrospinal fluid and blood usingmicrodialysis coupled with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2008,874(1-2):77-83.

        Study on local pharmacokinetics of baicalin gel after transdermal adm inistration in rats by skin m icrodialysis in vivo

        LOU Yuefen1,ZHU Quangang2,3,YOU Benming3,LI Jie3,GU Xiaoyan2,ZHANG Ruoxi2(1.Department of Pharmacy,Branch of Shanghai First People's Hospital,Shanghai 200081,China;2.Department of Pharmacy,Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai200437,China;3.Department of Pharmacy,Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)

        Objective Todevelop a novel skin microdialysis technology in vivo,and to determine the pharmacokinetic of baicalin after transdermaladministration in rats.MethodsAn HPLC-MS/MSmethod used for the determination of baicalin in skinmicrodialysis sampleswas established,SD ratswere pretreated with skin microdialysis operation under anesthesia,and then the baicalin gel was applied to the skin surface of probe in vivo.The baicalin concentration of skin microdialysates was determined,the time curve of baicalin concentration was drawn and the topical pharmacokinetics parameters of percutaneous absorption was calculated.ResultsBaicalin was optimized at the transitions m/z447.3→271.2.The linearity correlation was good and the assay exhibited good precision and accuracy.The subcutaneous probe recovery of baicalin in vivo was(24.40±0.91)%and was stable over the 240 min study period.Baicalin could be detected in the microdialysis samples after transdermal administration,and its concentration continued to rise in 8 h. AUC0-t in skin tissue was(50.04±34.17)mg·min·L-1.Conclusion Themethod of skin microdialysis in vivo could be used in the local pharmacokinetic research of baicalin.

        baicalin gel;microdialysis;dermatopharmacokinetics;rat

        R932,R943.43 [< class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

        A

        1006-0111(2014)06-0444-04< class="emphasis_bold">[DOI] 1

        10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.011

        2014-01-02

        2014-09-03[本文編輯]陳靜[收稿日期]2013-06-07[修回日期]2013-12-20[本文編輯]李睿旻

        上海市衛(wèi)生局課題(20114061);上海市教委預(yù)算內(nèi)項(xiàng)目(2013JW51);上海市藥理學(xué)會(huì)皮膚藥理學(xué)專業(yè)委員會(huì)基金(No. 201302).

        婁月芬,碩士,副主任藥師.E-mail:louyuefen@sina.cn.

        朱全剛,博士,副主任藥師.E-mail:qgzhu@126.com.

        在體皮膚微透析法可用于黃芩苷經(jīng)皮吸收局部藥動(dòng)學(xué)研究。

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