程晶晶，劉謀治，李洪嬌，閻瀾，姜遠英，顏天華(.武警河南省總隊醫(yī)院藥劑科，河南鄭州 50000;.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 0009;.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院，上海 00;.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 00)

·論著·

新化合物TG6對心肌缺血/再灌注損傷的影響及機制研究

程晶晶1，劉謀治2，李洪嬌3，閻瀾4，姜遠英4，顏天華2(1.武警河南省總隊醫(yī)院藥劑科，河南鄭州 450000;2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210009;3.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院，上海 200433;4.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

目的研究TG6對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用及機制。方法采用整體大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)實驗，離體大鼠心臟低灌復(fù)灌實驗和乳鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷(H/R)實驗等模型，以血清CK、LDH、T-SOD、MDA等為指標，研究TG6對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。結(jié)果在整體大鼠心肌缺血再灌注損傷實驗中，TG6顯著減少I/R損傷后心肌梗死面積，減少血清中CK活力和MDA含量，減少LDH活力，增加T-SOD活力;在離體大鼠心臟低灌復(fù)灌實驗中，TG6顯著增加低灌復(fù)灌后心肌冠脈流量，減少心肌組織中MDA含量和CK、LDH外漏，提高心肌組織中T-SOD活力;在乳鼠心肌細胞H/R損傷實驗中，TG6對正常生長條件下的細胞沒有明顯影響，提高Na2S2O4制備的心肌細胞H/R模型下細胞的存活率、降低細胞CK的釋放率及細胞［Ca2+］i的含量。結(jié)論 TG6對心肌I/R損傷有一定的保護作用。

鈉氫交換器抑制劑;心肌缺血/再灌注;冠脈結(jié)扎;離體心臟灌流;心肌細胞;缺氧/復(fù)氧

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是指缺血期處于可逆損傷的心肌細胞恢復(fù)血液供應(yīng)后產(chǎn)生更為嚴重的損傷，主要包括:炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細胞損傷、血流障礙、心肌細胞壞死和凋亡所致的心肌梗死面積(MIS)擴大等。隨著冠狀動脈搭橋術(shù)(CABG)、經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)成形術(shù)(PTCA)、溶栓療法等血管再通術(shù)的迅速開展，急性心肌梗死(AMI)再灌注治療出現(xiàn)了一個飛躍［1］。目前MIRI是阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要難題，如何減輕MIRI成為臨床上的新挑戰(zhàn)。

鈉氫交換器(Na+-H+exchanger，NHE)是一種在多種哺乳動物細胞中均有表達的蛋白質(zhì)，它在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH值，維持Na+和Ca2+穩(wěn)定方面起重要的調(diào)節(jié)作用［2］。目前，已經(jīng)有10種NHE亞型(NHE1～NHE10)被確認［3］，其中NHE1在組織中普遍分布，尤其在心肌細胞中占絕大多數(shù)，因此NHE1在調(diào)節(jié)心肌功能方面起重要作用。在對心肌缺血再灌注損傷機制研究過程中發(fā)現(xiàn)，心肌在缺血再灌注損傷時可激活NHE，進而引起Na+-Ca2+交換，致細胞內(nèi)Ca2+超負荷，造成心肌細胞損傷。根據(jù)這種病理生理基礎(chǔ)研究提示，Na+-H+交換抑制劑(sodium hydrogen exchange inhibitor，NHEI)有可能為防止心肌細胞損傷提供新的治療方法［4］。

中國藥科大學(xué)新藥研究中心將卡立泊來德(cariporide)分子的有效基團與曲美他嗪分子的有效基團相結(jié)合，合成了一系列化合物。經(jīng)初步篩選，發(fā)現(xiàn)化合物TG6作用突出，經(jīng)查新證實為結(jié)構(gòu)新型的化合物(圖1)。

圖1 TG6化學(xué)結(jié)構(gòu)式

TG6分子可能兼具NHE1抑制劑和代謝類藥的特點，其作用機制可能與減輕氧自由基損傷、改善自由基清除系統(tǒng)平衡、擴張冠狀動脈、改善心肌能量代謝、抑制細胞內(nèi)Ca2+超載等有關(guān)，有望成為預(yù)防和治療心肌缺血再灌注損傷的新藥。本研究旨在觀察TG6在缺血再灌注損傷保護方面的作用效果和機制，為其臨床應(yīng)用和進一步研發(fā)提供可靠的理論依據(jù)和思路。

1 材料和方法

1.1 藥品與材料TG6、卡立泊來德、鹽酸曲美他嗪均由中國藥科大學(xué)新藥研究中心提供;連二亞硫酸鈉(Na2S2O4·2H2O，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn));二甲亞砜(DMSO)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);肌酸激酶(CK)測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、丙二醛測定(MDA)試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒、超微量Na+，K+-ATP酶測定試劑盒均由南京建成生物試劑有限公司生產(chǎn)。

SD大鼠，雄性，220～250 g(第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，合格證:SCXK(滬)2007-0003)。

1.2 方法

1.2.1 TG6對冠脈結(jié)扎造成SD大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的影響大鼠用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺上，肢體導(dǎo)聯(lián)監(jiān)測心電圖，記錄正常心電圖。氣管插管，接動物人工呼吸機進行人工呼吸，左側(cè)第4肋間開胸，剪開心包暴露心肌，并用圓形無創(chuàng)縫合針5-0絲線置于左冠狀動脈前降支起始部下2 mm處備用。結(jié)扎冠狀動脈，以ECGⅡ?qū)?lián)ST段抬高或T波高聳、心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功的標志［5］。結(jié)扎45min后松開結(jié)扎線再灌注90min。56只清潔級雄性SD大鼠隨機分為7組(每組8只):模型組;假手術(shù)組(冠狀動脈下只穿線不結(jié)扎，其余操作同模型組);卡立泊來德(1 mg/kg)組;曲美他嗪(5 mg/kg)組;TG6高劑量組(1 mg/kg)、中劑量組(0.5 mg/kg)、低劑量組(0.25 mg/kg)?？⒉磥淼拢浪?，TG6高、中、低劑量均在再灌注前5 min于尾靜脈給予。

1.2.2 TG6對大鼠離體心臟低灌/復(fù)灌損傷的影響80只清潔級雄性SD大鼠隨機分為8組(n= 10):正常對照組，用改良K-H液以正常流速灌注80 min;模型組，平衡20 min后用改良K-H液低灌30 min，再復(fù)灌30 min;溶媒組，低灌液為含0.001%DMSO的改良K-H液，其余同模型組;曲美他嗪組，低灌液為含50μmol/L曲美他嗪的改良K-H液，其余同模型組;卡立泊來德組，低灌液為含10μmol/L卡立泊來德的改良K-H液，其余同模型組;TG6高、中、低劑量組，低灌液分別為含50、10、2μmol/L TG6的改良K-H液，其余均同模型組。實驗前將大鼠脫頸處死，迅速開胸，快速取下心臟放入改良的K-H緩沖液冰浴中洗凈殘血，迅速主動脈插管懸掛心臟于改良的Langendorff灌流裝置上［5］，用改良的K-H緩沖液(以95%O2和5%CO2飽和)行主動脈逆行灌流(速度5～7 ml/min)，溫度穩(wěn)定在37℃，然后依據(jù)各組別進行處理。

1.2.3 TG6對乳鼠心肌細胞缺氧再復(fù)氧損傷的影響體外培養(yǎng)原代乳鼠心肌細胞［7］，采用連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)引起的心肌細胞缺氧/復(fù)氧模型來考察TG6對缺氧/復(fù)氧損傷的影響［8］。TG6在復(fù)氧前給予，MTT法測定心肌細胞存活率，并測定細胞培養(yǎng)液中肌酸激酶(CK)含量以及細胞中Ca2+的含量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)用ˉx±s表示。采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析，單因素方差分析進行組間顯著性比較，兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TG6對冠脈結(jié)扎造成SD大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的影響

2.1.1 TG6對大鼠心肌梗死范圍的影響假手術(shù)組的心肌梗死區(qū)不明顯，而缺血再灌注模型組的心肌梗死范圍明顯(P＜0.01)。給藥組各組不同程度地減少了心肌梗死范圍，與模型組比較具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果顯示，TG6對冠脈結(jié)扎所致缺血再灌注損傷有明顯的保護作用。結(jié)果見圖2。

圖2 TG6對缺血45m in后再灌注90 m in的大鼠心肌梗死范圍的影響(n=8，ˉx±s)

2.1.2 TG6對大鼠血清中CK、LDH、T-SOD活力及MDA含量的影響模型組血清中CK、LDH活力、MDA的含量明顯高于假手術(shù)組，T-SOD活力明顯低于假手術(shù)組，兩者相比有顯著性差異(P＜0.01)。TG6高劑量組血清中CK、LDH、T-SOD活力、MDA含量分別與卡立泊來德組、曲美他嗪組比較，無顯著性差異(P＞0.05)。TG6投給劑量越大，血清中CK、LDH活力和MDA含量越低，T-SOD活力越高。結(jié)果顯示，TG6具有抗氧化損傷、減少過氧化產(chǎn)物的作用，可減少缺血再灌注引起的心肌細胞膜損傷。結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 TG6對缺血45m in后再灌注90 m in的大鼠血清中LDH、CK和SOD含量的影響(n=8，ˉx±s)

2.2 TG6對離體大鼠心臟低灌復(fù)灌的影響模型組復(fù)灌初和復(fù)灌末的冠脈流量明顯低于對照組(P＜0.01)。溶媒組與模型組無明顯差異(P＞0.05)。各給藥組的復(fù)灌初和復(fù)灌末的冠脈流量都明顯高于模型組(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果顯示，TG6有擴張冠狀動脈的作用，見圖5。模型組心肌組織中的

圖4 TG6對缺血45m in后再灌注90 m in的大鼠血清中MDA含量的影響(n=8，ˉx±s)

圖5 TG 6對30 m in低灌后再復(fù)灌30 m in的離體大鼠心臟冠脈血流量的影響(n=8，ˉx±s)

CK、LDH、T-SOD活力明顯低于對照組(P＜0.01)，而MDA含量明顯高于對照組(P＜0.01)。溶媒組與模型組比較無明顯差異(P＞0.05)。各給藥組心肌組織中的CK、LDH、T-SOD活力都明顯高于模型組(P＜0.05，P＜0.01)，而MDA含量低于模型組(P＜0.05，P＜0.01)。TG6高劑量組心肌組織中的CK、LDH、TSOD活力和MDA含量分別與曲美他嗪組和卡立泊來德組相比均無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)果進一步提示，TG6對離體心臟的缺血再灌注損傷也有保護作用，見圖6、圖7。

圖6 TG6對30 m in低灌后再復(fù)灌30m in的離體大鼠心臟中CK、LDH和T-SOD活性的影響(n=8，ˉx±s)

圖7 TG6對30 m in低灌后再復(fù)灌30m in的離體大鼠心臟中MDA含量的影響(n=8，ˉx±s)

2.3 TG6對Na2S2O4引起乳鼠心肌細胞缺氧再復(fù)氧損傷的影響與對照組比較，模型組細胞的存活率明顯下降(P＜0.01);同時細胞內(nèi)CK釋放率和Ca2+含量也顯著升高(P＜0.01)，均表明心肌細胞受到嚴重損傷、活性下降。復(fù)氧前給予藥物孵育1 h后，與模型組比較，卡立泊來德組(10-4mol/L)和TG6高、中劑量組(10-4、10-5mol/L)均不同程度地改善了心肌細胞的缺氧/復(fù)氧損傷，顯著提高了乳鼠心肌細胞的存活率，明顯降低了細胞內(nèi)CK的釋放率和Ca2+含量(P＜0.01，P＜0.05)。說明TG6對Na2S2O4引起的缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細胞有一定的保護作用。結(jié)果見表1、表2。

表1 再灌注前給予TG6對乳鼠心肌細胞存活率的影響(n=6，ˉx±s)

表2 再灌注前給予TG6對Na2 S2O4損傷的乳鼠心肌細胞中Ca2+含量及CK釋放率的影響(n=6，ˉx±s)

3 結(jié)論

綜上所述，筆者通過整體大鼠冠脈結(jié)扎缺血及再灌注實驗，首次發(fā)現(xiàn)TG6能減輕心肌缺血再灌注損傷，具有減少自由基損傷的作用;通過離體大鼠心臟低灌復(fù)灌實驗，首次發(fā)現(xiàn)TG6改善心肌缺血再灌注損傷的機制還與擴張冠狀動脈、改善心肌組織能量代謝有關(guān);通過乳鼠心肌細胞實驗，首次發(fā)現(xiàn)TG6對心肌細胞的缺氧/復(fù)氧損傷有保護作用，可以穩(wěn)定細胞膜、減少細胞內(nèi)Ca2+超載。結(jié)果顯示，TG6對心肌缺血再灌注具有顯著的保護作用。

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Effects and mechanism of TG6 on m yocardial ischem ia and reperfusion injury

CHENG Jingjing1，LIU Mouzhi2，LIHongjiao3，YAN Lan4，JIANG Yuanying4，YAN Tianhua2(1.Department of Pharmacy，Henan People＇s Armed Police Corps Hospital，Zhengzhou 450000，China;2.School of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China;3.Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University，Shanghai 200433，China;4.School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai200433，China)

Objective Toinvestigate the protective effects and mechanism of TG6 onmyocardial ischemia/reperfusion injury.Methodsthe protective effects of TG6 on myocardial ischemia/reperfusion was investigated by setting up models of ischemia and reperfusion of rats induced by ligating the left coronary anterior descending artery in vivo，isolated rathearts through an improved Langendorff device，and hypoxia/reoxygenation injury of neonatal rat cardiomyocytes，and the serum CK，LDH，T-SOD，MDA were taken as research markers.ResultsTG6 significantly reduced themyocardial infarct size，decreased the activity of CK and the content of MDA in serum，reduced the activity of LDH，and increased the activity of T-SOD in vivo;TG6 obviously increased the coronary blood flow after low rate perfusion and reperfusion，decreased the contentofMDA and the leakage of CK，LDH inmyocardial tissue，elevated the activity of T-SOD in vitro of isolated rat hearts;TG6 had no effects on cells in normal growth condition，raised the viability of cardiomyocytes significantly，and reduced the rate of CK leakage and the content of［Ca2+］iobviously in Na2S2O4treated cells in vitro of neonatal rat cardiomyocytes.ConclusionTG6 could effectively protectmyocardial ischemia/reperfusion injury.

NHEI;myocardial ischemia/reperfusion;coronary artery ligation;isolated heart perfusion;cardiomyocyte;H/R

R541.6 ［文獻標志碼］A ［文章編號］1006-0111(2014)06-0440-04

10.3969/j.issn.1006-0111.2014.06.010

2013-10-09

2014-03-19［本文編輯］李睿旻

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2012ZX09103101-069).［作者簡介］程晶晶，藥師.Tel:18625598588，E-mail:jinganswer_890721 @126.com.

顏天華.E-mail:yth0001@126.com.