吳 丹 ，聶燕釵 ，曹 禹 ，曹 淵 ，周懷谷

（1.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場應(yīng)用技術(shù)公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 200083；2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院，上海 200032；3.無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江蘇 無錫 214174）

人類線粒體DNA（mtDNA）是位于細胞核以外的唯一基因組DNA，具有突變率高、遵循母系遺傳的特點，與每個體細胞核DNA只有兩個拷貝相比，其mtDNA則有成百上千個拷貝，因此，對那些因微量、降解、腐敗等原因而造成核DNA分型失敗的生物檢材進行mtDNA檢測分析成為法醫(yī)物證領(lǐng)域又一重要的技術(shù)手段[1]。同時，在母系親緣關(guān)系認定、大型災(zāi)難調(diào)查、考古研究等方面，mtDNA檢測分析也顯示出良好的應(yīng)用前景。目前常規(guī)的mtDNA檢測方法仍然是對其高變區(qū)的直接測序，存在步驟繁瑣、費時費力、測序區(qū)段有限等缺陷，大大影響了mtDNA在法醫(yī)物證領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。

本研究利用單核苷酸多態(tài)性（SNP）遺傳標(biāo)記分布廣泛、遺傳穩(wěn)定、分析片段短、可實現(xiàn)高通量、自動化檢測等特點[2]，結(jié)合等位基因特異性引物擴增和毛細管電泳檢測，開發(fā)建立一種16個mtDNA SNP的復(fù)合檢測體系，對mtDNA進行簡便、有效的高通量分型提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

50份漢族無關(guān)個體FTA卡血液樣本，通風(fēng)干燥處保存。

1.2 主要儀器與試劑

QIAcube多功能全自動樣本制備工作站（德國QIAGEN公司），9700型PCR擴增儀（美國AB公司），7500實時熒光PCR儀（美國AB公司），3130XL遺傳分析儀（美國AB公司），Quantifiler DNA定量試劑盒（美國 AB 公司），Wizard?DNA Clean-up System（美國 Promega公司），BigDye Terminator Cycle Sequencing試劑盒（美國AB公司）。

1.3 提取DNA與定量分析

應(yīng)用QIAcube多功能全自動樣本制備工作站提取FTA卡血樣DNA，詳見使用說明。所得DNA采用Quantifiler DNA定量試劑盒，7500實時熒光PCR儀和SDS v1.2.3軟件進行定量分析。

1.4 SNP位點的選擇

參考文獻[3]并綜合考慮高變異率、引物設(shè)計、Tm值等諸多因素，最終確定亞洲人群中多態(tài)性較高的16個SNP，并以其在mtDNA的序列位置命名，即分別為：152、709、3010、3970、5178、8414、9 bp、9540、10398、10873、12705、13928、14783、15043、16311、16362，其中8281~8289位置堿基序列為CCCCCTCTA，與前面8272~8280的9個堿基形成重復(fù)，有時整體缺失，以其序列重復(fù)或缺失分別標(biāo)記為NORM或DEL。

1.5 引物的設(shè)計與合成

等位基因特異性引物的設(shè)計：針對每個SNP標(biāo)記，設(shè)計3條引物，2條上游等位基因特異性引物序列3′末端分別與二態(tài)SNP的兩種分型相對應(yīng)；為限制非特異性延伸，在近其3′端倒數(shù)第3或第4位引入一個錯配堿基，兩條引物在長度上相差4 bp，以示區(qū)分；下游為公用引物，并用FAM熒光標(biāo)記。

測序引物：以300～400bp測序長度為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計14對測序引物，測序片段覆蓋全部16個mtDNA SNP標(biāo)記。

引物設(shè)計采用Premier 5.0和Oliog 6.0軟件完成，由上海Sangon公司合成。

1.6 復(fù)合擴增體系的建立

參照理論Tm值，通過引物濃度配比調(diào)整和優(yōu)化擴增條件等手段，最終確定復(fù)合擴增體系為10μL，包括反應(yīng)混合液 4μL，引物 2μL，C-Taq（5U/μL） 0.2μL，模板DNA 2μL，補純水至10μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃ 3min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，30 個循環(huán)；72℃ 20min。

1.7 毛細管電泳分型檢測

電泳分析，取PCR產(chǎn)物1μL，mtSNP等位基因分形標(biāo)準(zhǔn)物1μL，分別與AGCU Marker SIZ-500 0.5μL和去離子甲酰胺12 μL混合，95℃變性3 min，冰浴3min，電泳檢測。

1.8 測序驗證

采用直接測序法進行驗證。設(shè)計測序引物，隨機抽取5個樣本，對16個SNP位點序列分別進行DNA測序。對獲得的16個SNP位點上的對應(yīng)堿基，與等位基因特異性引物擴增結(jié)果進行比較確認。

2 結(jié) 果

2.1 16個mtDNA SNP的復(fù)合擴增和分型

采用等位基因特異性引物法，對50份無關(guān)個體樣本DNA進行復(fù)合擴增，9947A作為陽性對照。經(jīng)毛細管電泳后，50個樣本均得到清晰的分型圖譜（圖1）。

圖1 一個體mtDNA SNP復(fù)合擴增毛細管電泳圖譜

2.2 靈敏度檢測

采用本檢測體系，樣本DNA經(jīng)倍比稀釋后，分別進行擴增檢測。結(jié)果顯示本復(fù)合擴增體系中，最低檢測量為0.1pg，當(dāng)模板量在0.5～10pg時能得到較理想的分型圖譜。

2.3 測序驗證結(jié)果

建立的復(fù)合檢測體系檢測結(jié)果與直接測序法結(jié)果一致（圖 2）。

圖2 直接測序法圖譜（9bp序列重復(fù)）

3 討 論

SNP是由基因組水平上的單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最能反映群體遺傳結(jié)構(gòu)和個體間遺傳差異的遺傳標(biāo)記之一。目前已開發(fā)的SNP檢測方法如利用熒光淬滅效應(yīng)和實時熒光檢測的TaqMan技術(shù)，檢材適應(yīng)性廣、穩(wěn)定性好，但成本高、探針設(shè)計難度高[4]；基于引物延伸原理的SNPShot微測序方法，結(jié)果穩(wěn)定可靠，現(xiàn)在應(yīng)用較多，但是仍然需要進行兩步擴增反應(yīng)[5]；高通量的檢測方法有等位基因特異性連接技術(shù)（SNPlex）[6]、基因芯片技術(shù)[7]以及基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜法（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）等，這些技術(shù)在應(yīng)用上仍有諸多缺陷，如需要大型專用設(shè)備、花費成本過高、耗時長等，不易在一般實驗室普及。

相比較之下，本研究建立的片段差異等位基因特異性引物法，操作簡便，DNA樣本經(jīng)一步擴增后，直接用于毛細管電泳分型檢測，在現(xiàn)有的法醫(yī)實驗室平臺上就能完成整個檢驗過程，耗時短。在特異性引物設(shè)計中，在其3′端區(qū)域引入一個錯配堿基，大大提高了引物延伸的特異性，降低了SNP分析的假陽性率[8]。在本檢測體系的16個mtDNA SNP位點上，復(fù)合檢測體系檢出結(jié)果與直接測序法結(jié)果完全一致，證明該方法分型結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

與直接測序法檢測的僅是線粒體高變區(qū)不同，本研究引入了13個編碼區(qū)SNP位點，由于編碼區(qū)承受的選擇壓力相對較大，堿基突變率低，分析編碼區(qū)的多態(tài)性位點無疑對法醫(yī)提高排除率起到積極作用[9]。

在建立的10 μL PCR復(fù)合擴增體系中，最低檢測量為0.1 pg細胞總DNA，當(dāng)模板量在0.5～10 pg時能得到較理想結(jié)果，與商業(yè)化的STR檢測試劑盒相比較，由于mtDNA的遺傳特性，本檢測體系顯示出更高的靈敏度。

綜上所述，本復(fù)合檢測體系操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好、分型準(zhǔn)確，可作為替代線粒體測序方法應(yīng)用于法庭科學(xué)檢驗，同時為法醫(yī)微量、降解、無核檢材的高通量分型提供了新的技術(shù)手段。在后續(xù)研究中，將進一步擴大檢測樣本，并通過群體遺傳學(xué)調(diào)查，探討其在法庭科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價值。

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