仲立新范 瑞

（1 河南省南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 腫瘤科，河南 南陽(yáng) 473000；2 河南省南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 病理科，河南 南陽(yáng) 473000）

探析多藥耐藥基因MDR1在卵巢癌化療中的價(jià)值

仲立新1范 瑞2

（1 河南省南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 腫瘤科，河南 南陽(yáng) 473000；2 河南省南陽(yáng)市第一人民醫(yī)院 病理科，河南 南陽(yáng) 473000）

目的探析多藥耐藥基因MDR1在卵巢癌化療中的價(jià)值。方法收集我院2012年2月至2014年2月收治的卵巢癌患者160例初治卵巢癌患者腫瘤組織標(biāo)本，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)MDR1基因表達(dá)情況，同時(shí)用四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥的敏感性。結(jié)果91例（56.875%）卵巢癌患者M(jìn)DR1基因表達(dá)陽(yáng)性；耐藥組和敏感組與MDR1基因表達(dá)陽(yáng)性和陰性的總符合率為81. 08%（P＞0.05）；卵巢癌組織中的MDR1表達(dá)與年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05）。MDR1基因表達(dá)陽(yáng)性和陰性與化療預(yù)后有關(guān)（P＜0. 05）。結(jié)論MDR1基因表達(dá)陰性患者應(yīng)用MDR相關(guān)藥物是有效的，陽(yáng)性患者應(yīng)避免應(yīng)用MDR相關(guān)藥物。MDR1的表達(dá)陰陽(yáng)性的檢測(cè)對(duì)臨床用藥有一定的指導(dǎo)價(jià)值，作為判斷卵巢癌患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。

多藥耐藥基因MDR1；卵巢腫瘤；化療；價(jià)值

卵巢腫瘤是是女性生殖系統(tǒng)中三大惡性腫瘤之一[1]。目前綜合治療方案是以手術(shù)為主、輔以化療、放療和生物治療。然而卵巢癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性[2]，嚴(yán)重影響了卵巢癌患者的化療效果和生存質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集我院2012年2月至2014年2月收治的卵巢癌患者160例經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)的卵巢癌患者腫瘤組織標(biāo)本，年齡19～71歲，且術(shù)前未經(jīng)MDR相關(guān)藥物化療。根據(jù)WHO分類標(biāo)準(zhǔn)分化程度進(jìn)行劃分，其中低分化100例，中分化43例，高分化9例。術(shù)中采集標(biāo)本立即置含營(yíng)養(yǎng)液的無(wú)菌瓶中，盡快送實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 腫瘤細(xì)胞制備方法

腫瘤離體后即刻進(jìn)行無(wú)菌取材，并用膠原酶消化腫瘤組織制成單細(xì)胞懸液備用。

1.2.1 MTT比色法

將單細(xì)胞懸液濃度調(diào)整為（1～5）×105個(gè)/毫升，設(shè)培養(yǎng)液對(duì)照組、腫瘤細(xì)胞對(duì)照組及加不同抗腫瘤藥物的實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)3個(gè)平行孔，每孔接種200 μL，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)每孔加抗腫瘤藥物20 μL培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)液對(duì)照組、腫瘤細(xì)胞對(duì)照組各加20 μL MTT培養(yǎng)4 h，1000 r/min離心10 min，棄上清，然后加入200 μL DMSO，搖勻，用SLT-400AT型酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在570 nm和630 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，按抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)孔A值/細(xì)胞對(duì)照孔A值）×100%，（A值=A570-A630）計(jì)算各種敏感藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率。按抑制率≥50%為敏感，否則為耐藥。

1.2.2 MDR1基因檢測(cè)

①RNA制備：將單細(xì)胞懸液用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。取1 μg總RNA，利用Promega公司提供的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA的PCR反應(yīng)模板。引物為北京賽百盛公司合成的MDR1（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為157 bp）及內(nèi)參照引物為β2微球蛋白（β2-MG）（擴(kuò)增產(chǎn)物為114 bp）。②PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）和10×buffer各3 μL，MgCl2為1.5 mmol/L，MDR1及β2微球蛋白引物各0.5 μmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，TaqDNA聚合酶1U。PCR反應(yīng)條件依次為95 ℃時(shí)間30 s，55 ℃時(shí)間30 s，72 ℃時(shí)間60 s，循環(huán)35次，最后72 ℃時(shí)間5 min結(jié)束。③PCR產(chǎn)物電泳：取10 μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在電壓為80V的含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中電泳1 h，用紫外透射儀觀察114 bp和157 bp擴(kuò)增條帶。若出現(xiàn)此基因特異性擴(kuò)增條帶者，為MDR1基因表達(dá)陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間差異應(yīng)用t檢驗(yàn)，P＜0.05說(shuō)明兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 β2-MG在所有組織標(biāo)本中均有表達(dá)，證明了逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA樣品是完整的。按有無(wú)MDR1基因表達(dá)分為兩組，陽(yáng)性組91例，占56.875%；陰性組69例，占43.125%。

2.2 MDR1基因表達(dá)與細(xì)胞耐藥水平。對(duì)MDR1基因表達(dá)陰陽(yáng)性與細(xì)胞耐藥水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)，耐藥組和敏感組與MDR1基因表達(dá)陽(yáng)性和陰性的總符合率為82.44%（P＞0.05）。說(shuō)明MDR1基因表達(dá)陰性患者應(yīng)用MDR相關(guān)藥物是有效的，陽(yáng)性患者應(yīng)避免應(yīng)用MDR相關(guān)藥物。MDR1的表達(dá)陰陽(yáng)性的檢測(cè)對(duì)臨床用藥有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

2.3 MDR1基因表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。本文160例卵巢癌患者隨訪資料149例，且均在半年以上，病情穩(wěn)定者133例，其中12例MDR1基因表達(dá)陽(yáng)性；病情嚴(yán)重、復(fù)發(fā)甚至死亡者27例，其中25例MDR1基因表達(dá)陽(yáng)性，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)，二者差異具有顯著性（P＞0.05）。MDR1基因的表達(dá)陰陽(yáng)性可作為判斷卵巢癌患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。如表1所示。

3 討 論

表1 MDR1基因表達(dá)與各因素關(guān)系的分析

多藥耐藥性是指癌細(xì)胞通過(guò)過(guò)度表達(dá)位于其細(xì)胞表面的糖蛋白，以利用鈣通道加快化療藥物向細(xì)胞內(nèi)外輸送而產(chǎn)生的抵抗抗癌藥物的一種自我保護(hù)措施。本實(shí)驗(yàn)選擇臨床上常用的11種抗癌藥物，應(yīng)用MTT法進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，其中MDR相關(guān)有7種藥物，即絲裂霉素（MMC）、更生霉素（DACT）、阿霉素（ADM）、表阿霉素（E-ADM）、長(zhǎng)春新堿（VCR）、鬼臼乙叉甙（VP16）和平陽(yáng)霉素（PYM）；其他為噻替哌（TSPA）、卡鉑（JM 8）、順鉑（CDDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）。DACT、ADM、E-ADM、VCR和VP16對(duì)卵巢癌細(xì)胞抑制率的差異有顯著性，其中VP16抑制率差異有高度顯著性，其余則無(wú)顯著性。結(jié)果說(shuō)明耐藥組和敏感組與MDR1基因表達(dá)陽(yáng)性和陰性的總符合率較高。據(jù)癌組織中MDR1的表達(dá)與否，對(duì)耐藥患者采用藥敏方案治療可助于提高療效，還可以對(duì)卵巢癌患者進(jìn)行預(yù)后判斷。

[1] Munksgaard PS,Blaakaer J. The association between endometriosis and gynecological cancers and breast cancer: a review of epidemiological data[J]. Gynecol Oncol,2011,123(1):157-163.

[2] Nooter K. Multidrug resistance(mdr)genes in human cancer[J].Br J Cancer,1991,63:663-669.

R737.31

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1671-8194（2014）22-0205-02