王 森 陳荏槐 康海鮮 姚運(yùn)紅 胡新榮 朱 偉*

（廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，廣東 東莞 523808）

利用RNA干擾技術(shù)探討STAT3對宮頸癌C33a細(xì)胞增殖的影響

王 森 陳荏槐 康海鮮 姚運(yùn)紅 胡新榮 朱 偉*

（廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，廣東 東莞 523808）

目的為了探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）對宮頸癌細(xì)胞的作用，我們利用RNAi干擾其表達(dá)，檢測其對C33a細(xì)胞增殖的影響。方法實(shí)驗(yàn)分組為對照組（即正常C33a細(xì)胞組）及干擾組（即RNA干擾STAT3組）。利用新型陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Hilymax導(dǎo)入STAT3 RNA干擾序列，而后檢測STAT3的表達(dá)，并利用CCK-8法檢測C33a的細(xì)胞增殖水平改變。結(jié)果與對照組相比，干擾組STAT3 mRNA下降約75%，顯示成功干擾STAT3的基因表達(dá)。與對照組相比，在1、2、3 d，干擾組細(xì)胞增殖水平較對照組抑制了約19.1%，31.2%，32.0%。結(jié)論本研究成功干擾C33a細(xì)胞STAT3的表達(dá)，且STAT3沉默可進(jìn)一步抑制C33a細(xì)胞增殖。

STAT3；C33a；RNA干擾

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白家族是一組可以被不同的細(xì)胞因子受體激活的蛋白。STAT3是其最為重要的家族成員之一，已有研究表明，STAT3對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用。為了探討STAT3對宮頸癌的作用，我們利用RNAi干擾其表達(dá)，檢測其對C33a細(xì)胞增殖的影響，以期為將來以STAT3為靶點(diǎn)進(jìn)行腫瘤的防治研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌C33a細(xì)胞為廣東醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所保存。Hilymax轉(zhuǎn)染試劑購自上海同仁化學(xué)。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司。STAT3的RNA干擾序列由廣州吉瑪生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)驗(yàn)中使用的CCK-8試劑盒購買于上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)分組為對照組（即正常C33a細(xì)胞組）及干擾組（即RNA干擾STAT3組）。利用新型陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Hilymax導(dǎo)入STAT3 RNA干擾序列，而后于48 h檢測STAT3的RNA表達(dá)，并利用CCK-8法檢測C33a的細(xì)胞增殖水平改變。

轉(zhuǎn)染步驟：Hilymax/siSTAT3=3/1的比例轉(zhuǎn)染C33a細(xì)胞（STAT3 RNA干擾序列為：5'-AAC AUC UGC CUA GAU CGG CUA dTdT-3'，3'-dTdT GUA GAC GGA UCU AGC CGA U-5'）。Trizol法提取總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。STAT3的引物序列為：上游引物：TGTGCGTATGGGAACACCTA；下游引物：AGAAGGTCGTCTCCCCCTTA；Realtime PCR反應(yīng)體系如下：首先加入10 μL 2× SYBR Green Master （ROX），而后加入10 μM引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，最后以ddH2O補(bǔ)足20 μL。

C33a細(xì)胞增殖檢驗(yàn)方法：將收獲的轉(zhuǎn)染后的各組6孔板細(xì)胞以每孔5000細(xì)胞的濃度鋪板于96孔板。于1、2、3 d時(shí)分別加入CCK8每孔10 μL，1～2 h后采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度值。細(xì)胞抑制率計(jì)算公式為：（對照組實(shí)際吸光度值/干擾組實(shí)際吸光度值-1）×100%。

2 結(jié) 果

采用Hilymax轉(zhuǎn)染試劑將STAT3的RNA干擾序列轉(zhuǎn)染宮頸癌C33a細(xì)胞，后進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，在RNA水平，干擾組STAT3 mRNA下降約75%，顯示成功干擾STAT3的基因表達(dá)（圖1A）。在細(xì)胞的增殖影響方面，CCK-8檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，在1、2、3 d，干擾組細(xì)胞增殖水平較對照組分別抑制了約19.1%，31.2%（P＜0.05），32.0%（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 RNA干擾STAT3的表達(dá)及其對C33a細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

宮頸癌是女性生命健康的最重要?dú)⑹种?，全世界宮頸癌病例每年有多于27萬患者死亡[1-3]。宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中牽涉到一系列的信號(hào)分子與通路，其中，信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）蛋白家族是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。STAT蛋白含有SH2和SH3結(jié)構(gòu)域，它們可與特定的肽段結(jié)合。STAT磷酸化后進(jìn)入胞核內(nèi)促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前已經(jīng)克隆了7種STAT基因：STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b，STAT6。其中，STAT3可能是宮頸癌的促癌因子。研究表明，宮頸癌組織中磷酸化STAT3表達(dá)增高，這提示了STAT3的促癌功能[4,5]。此外，STAT3也能夠促進(jìn)很多明確的促癌因子如VEGF，MMP-9等的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮促瘤功能[6,7]。因此，本實(shí)驗(yàn)初步選擇STAT3作為靶向目標(biāo)，也為將來的深入研究做一鋪墊。

RNAi技術(shù)利用短鏈RNA（siRNA）直接結(jié)合靶mRNA后導(dǎo)致其降解，從而敲減基因的表達(dá)，研究已證明RNAi技術(shù)是觀察基因功能的有效方法。我們利用RNA干擾技術(shù)成功干擾了C33a細(xì)胞中STAT3的表達(dá)，其mRNA表達(dá)下降約75%。STAT3被敲減后，干擾組C33a細(xì)胞的增殖受到抑制?？傊?，本研究成功干擾C33a細(xì)胞STAT3的表達(dá)，且STAT3沉默可進(jìn)一步抑制C33a細(xì)胞增殖。

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R73

B

1671-8194（2014）22-0081-02

國家自然科學(xué)基金（81302244）；廣東省自然科學(xué)基金博士啟動(dòng)項(xiàng)目（S2012040006311，S2012040006383）；廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研基金（編號(hào)：B2013293）；廣東醫(yī)學(xué)院科研基金項(xiàng)目（B2011004，B2011012）

*通訊作者