黃 濤陶 杰周孜輝周 淵宋登新傅燕飛

（1 上海第一人民醫(yī)院寶山分院骨科，上海 200940；2 上海第一人民醫(yī)院骨科，上海 200080；3 上海第一人民醫(yī)院寶山分院放射科，上海 200940）

骨內(nèi)應(yīng)力環(huán)境下復(fù)合血管內(nèi)皮生長因子骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)傷性股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究

黃 濤1陶 杰2周孜輝2周 淵1宋登新1傅燕飛3

（1 上海第一人民醫(yī)院寶山分院骨科，上海 200940；2 上海第一人民醫(yī)院骨科，上海 200080；3 上海第一人民醫(yī)院寶山分院放射科，上海 200940）

目的探討骨內(nèi)應(yīng)力對(duì)轉(zhuǎn)染VEGF基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)創(chuàng)傷性股骨頭壞死的作用。方法設(shè)計(jì)制作能骨內(nèi)加壓的空心螺釘，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染VEGF基因，20只實(shí)驗(yàn)犬通過手術(shù)截?cái)喙晒穷i方法造模，根據(jù)術(shù)后不同的處理方法分為四組：A組（單純空心螺釘固定）；B組（空心螺釘加人工骨填塞）；C組（空心螺釘加復(fù)合轉(zhuǎn)染VEGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的人工骨填塞）；D組（空心螺釘加復(fù)合轉(zhuǎn)染VEGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的人工骨填塞，同時(shí)加壓）。造模20周后，行大體觀察、X線及組織學(xué)、免疫組化及Western blot檢測(cè)骨修復(fù)效果。結(jié)果通過手術(shù)方式成功制作出創(chuàng)傷性股骨頭壞死的動(dòng)物模型；在造模20周后，D組血管計(jì)數(shù)和VEGF的蛋白含量明顯高于其他三組（P＜0.05）；C組血管計(jì)數(shù)和VEGF的蛋白含量高于A組和B組，有顯著性差異（P＜0.05），低于D組比較有顯著性差別（P＜0.05）；A組和B組血管計(jì)數(shù)和VEGF蛋白水平遠(yuǎn)低于C組和D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組和B組血管計(jì)數(shù)和VEGF蛋白水平之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論骨內(nèi)加壓能顯著提高轉(zhuǎn)染VEGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷性股骨頭壞死的再血管化，適當(dāng)?shù)膽?yīng)力刺激有利于骨組織的修復(fù)。

股骨頭壞死；應(yīng)力；間充質(zhì)干細(xì)胞；血管內(nèi)皮生長因子；修復(fù)

股骨頭缺血性壞死塌陷和骨折不愈合是股骨頸骨折術(shù)后兩大并發(fā)癥。近年來，隨著內(nèi)固定技術(shù)的改進(jìn)，骨折不愈合率已明顯降低，但股骨頭缺血性壞死塌陷的發(fā)生并沒有根本改觀，這也成為一直困擾創(chuàng)傷骨科界的一大難題。

目前對(duì)于股骨頭壞死的早期保髖處理，有髓芯減壓術(shù)、轉(zhuǎn)子間截骨術(shù)，帶血管蒂肌蒂骨瓣移植術(shù)、多孔鉭棒植入術(shù)等多種方法使用，針對(duì)的均是已發(fā)生股骨頭壞死的病例。而對(duì)于股骨頸骨折而言，如何能在早期牢固固定骨折，促進(jìn)骨組織修復(fù)；快速重建股骨頭血供，促進(jìn)新生骨血管化和加強(qiáng)股骨頭軟骨下支撐等方面取得一個(gè)相對(duì)好的平衡，從而在治療骨折的同時(shí)減少甚至達(dá)到避免股骨頭壞死的發(fā)生仍是一個(gè)有待解決的課題。

Wolff定律指出適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激造成骨生長質(zhì)和量的改變。有研究也發(fā)現(xiàn)縱向壓力誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分化成骨[1]，我們思考：能否通過某種設(shè)計(jì)使在骨折內(nèi)固定的同時(shí)能即時(shí)在骨內(nèi)施加一定的應(yīng)力，從而促使局部骨的快速修復(fù)？結(jié)合臨床實(shí)際，我們?cè)O(shè)計(jì)了能骨內(nèi)局部加壓的空心螺釘，結(jié)合轉(zhuǎn)染了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的應(yīng)用，以期為創(chuàng)傷性股骨頭壞死的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 骨內(nèi)應(yīng)力傳導(dǎo)裝置的設(shè)計(jì)

根據(jù)中青年人股骨頸骨折保頭手術(shù)常用三枚空心加壓螺釘固定的手術(shù)方法，采用兩部分設(shè)計(jì)能夠骨內(nèi)加壓的應(yīng)力傳導(dǎo)裝置。為保證螺釘強(qiáng)度和加壓的同步，我們對(duì)普通空心加壓螺釘進(jìn)行了改制（圖1）。螺釘基本參數(shù)：釘長35 mm，外徑6.5 mm，內(nèi)徑3.5 mm，壁厚0.8 mm，螺紋0.7 mm，牙距0.8 mm，牙數(shù)：頭端6。釘尾頭型：十字內(nèi)凹平頭，外徑10 mm，內(nèi)徑8 mm。加壓裝置：圓柱螺旋壓縮彈簧。自由行程8 mm，通過彈簧回彈力測(cè)試儀測(cè)試在壓縮行程5 mm時(shí)（平均三次），可提供（8.1±0.053）N的回彈力。當(dāng)螺釘中孔填滿固態(tài)物質(zhì)后，即可通過彈簧的壓縮對(duì)釘頭加壓。裝置訂做廠家：蘇州康力骨科器械有限公司。

圖1

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組

選取健康雜種犬20只，雌雄不限，體質(zhì)量（16.9±2.1）kg，犬齡3～5年，上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共40只股骨頭，全部納入實(shí)驗(yàn)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭隨機(jī)分為A、B、C、D4組，每組各十只股骨頭。動(dòng)物造模后，A組動(dòng)物為造模后定制空心螺釘內(nèi)固定組，B組動(dòng)物為造模后，定制空心螺釘結(jié)合人工骨修復(fù)組，C組為造模后，空心螺釘結(jié)合VEGF-165基因轉(zhuǎn)染的MSCs修復(fù)組，D組造模后，骨內(nèi)加壓、空心螺釘結(jié)合VEGF-165基因轉(zhuǎn)染的MSCs修復(fù)組。

1.3 主要儀器和試劑

光學(xué)倒置顯微鏡日本Olympus公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀美國Becton-Dickinson公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清美國GIBCO 公司；pCI –neo-hVEGF-165質(zhì)粒由本中心實(shí)驗(yàn)室保存；LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒美國Life Technologies Corporation公司；蛋白抽提試劑盒、SABC三步法試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗體、羊抗兔IgG抗體 美國Abcam公司；專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0美國Media Cybernetics公司

1.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及目的基因轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)犬行髂嵴穿刺，抽取骨髓約3 mL，密度梯度離心法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）至第3代，培養(yǎng)液為含20%胎牛血清DMEM液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD31、CD34、CD105的表達(dá)。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pCI–neo-hVEGF-165基因進(jìn)入MSCs，設(shè)置陽性對(duì)照組（pCI-neo空質(zhì)粒組）與陰性對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)液組）。轉(zhuǎn)染試劑為陽離子脂質(zhì)體LipofectAMINETM2000，具體方法按說明書進(jìn)行。G418篩選。ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液中VEGF濃度。將陽性克隆分散在96孔板中，依據(jù)上清液中VEGF濃度進(jìn)一步篩選、擴(kuò)增高表達(dá)克隆。消化細(xì)胞并將細(xì)胞配制成1×108/mL細(xì)胞懸液，復(fù)合于多孔人工骨上，在培養(yǎng)箱中孵育4 h備用。

1.5 動(dòng)物模型的建立

參與實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物，采用Swiontkowski等的方法[2]，模擬臨床股骨頸骨折的過程，制作創(chuàng)傷性股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。犬俯臥位固定，40mg/kg硫賁妥鈉腹腔注射麻醉。采用髖關(guān)節(jié)外側(cè)入路，切開闊筋膜張肌，顯露臀中肌和臀深部肌群，從間隙進(jìn)入，切開關(guān)節(jié)囊，在股骨頭半脫位的情況下，用擺鋸造成股骨頸完全骨折。再重新解剖對(duì)位后，股骨頭使用定制空心螺釘沿大粗隆下股外側(cè)皮質(zhì)向股骨頭中心點(diǎn)行內(nèi)固定，外側(cè)皮質(zhì)擴(kuò)孔到10 mm，用套筒扳手將定制螺釘擰入，盡量使螺釘尾端深入外側(cè)皮質(zhì)內(nèi)，以增加穩(wěn)定性。A組造模后定制空心螺釘內(nèi)固定，B組造模后，空心螺釘內(nèi)固定，螺釘孔內(nèi)克氏針填入人工骨并夯實(shí)，C組股骨頭使用定制空心螺釘固定完成后，在螺釘釘孔內(nèi)用克氏針填入復(fù)合有VEGF-165基因轉(zhuǎn)染的MSCs的人工骨并夯實(shí)。D組股骨頭使用定制空心螺釘固定，在螺釘釘孔內(nèi)用克氏針填入復(fù)合有VEGF-165基因轉(zhuǎn)染的MSCs的人工骨，夯實(shí)后在螺釘頭端使用彈簧進(jìn)行加壓。術(shù)畢縫合傷口。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后24 h內(nèi)限制活動(dòng)。常規(guī)肌注青霉素G80萬單位以預(yù)防感染。

1.6 標(biāo)本制作和觀察

①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物統(tǒng)一在20周后取材檢測(cè)。取材前統(tǒng)一在電壓55 kV、電流10 mAs、距離1 m 的條件下拍攝雙側(cè)股骨頭正位片。②標(biāo)本采集：取出股骨頭，縱向鋸開，一部分裝入凍存管，深低溫冰箱凍存；另一部分10%甲醛固定，5%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液對(duì)樣本進(jìn)行充分脫鈣。③切片組織學(xué)檢測(cè)：將5%EDTA脫鈣后的標(biāo)本取出，逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，厚度為4 μm，蘇木精一伊紅（HE）染色，光鏡觀察。④切片免疫組化血管染色檢測(cè)并血管計(jì)數(shù)：切片厚度4 μm，按SABC三步法試劑盒說明書進(jìn)行染色。一抗兔抗人CD34多克隆杭體1∶150，二抗生物素化羊抗兔IgG。陽性染色表現(xiàn)為棕黃色，定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)。應(yīng)用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行血管計(jì)數(shù)，每片隨機(jī)選取三個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值。⑤Western blot檢測(cè)骨組織中VEGF蛋白表達(dá)：4組凍存的股骨頭標(biāo)本，分別碾磨粉碎后，加入總蛋白提取液，用組織勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體。將勻漿物在4 ℃，10000 rpm條件下離心5 min，取上清與1×SDS凝膠上樣緩沖液混合，并加入不超過4%體積的β一巰基乙醇（β-mercaptoethenal）一起煮沸5 min。上樣經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，標(biāo)記方向后1%脫脂奶粉室溫封閉過夜。洗膜后加入兔抗人VEGF多克隆抗體（體積比1∶500）37 ℃下雜交2 h，隨后洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（體積比1∶2000）室溫雜交1 h，最后經(jīng)顯色反應(yīng)并曝光于X線膠片上。選擇GAPDH作為內(nèi)參。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0對(duì)圖像的光密度比照內(nèi)參條帶光密度進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用（）表示，差異的顯著性用組間t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，定義P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后動(dòng)物及股骨頭肉眼觀察

全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均術(shù)后存活，無明顯傷口感染。術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精神稍差，活動(dòng)減少，進(jìn)食量減少，雙側(cè)后肢輕度跛行。1～2周后進(jìn)食增加，步態(tài)轉(zhuǎn)好，活動(dòng)增加。2周后大部分傷口縫線自行脫落，傷口愈合。20周取材時(shí)，全部20只實(shí)驗(yàn)犬均能正常行走。

20周時(shí)，A組10只標(biāo)本骨折處不同程度愈合，未見骨不連。股骨頭外形基本規(guī)整，部分股骨頭失去球形外形，呈扁平，有5只股骨頭可見軟節(jié)軟骨部分剝脫，殘留軟骨呈蒼白色。B組標(biāo)本骨折基本愈合，10只股骨頭外形基本規(guī)整呈圓形，有6只股骨頭可見軟節(jié)軟骨不同程度剝脫，殘留軟骨呈蒼白色，其中一只股骨頭似可見輕度塌陷征象。C組標(biāo)本骨折愈合，10只股骨頭外形基本規(guī)整呈圓形，顏色稍蒼白，未見明顯軟骨剝脫或表面粗糙。D組標(biāo)本骨折愈合，10只股骨頭外形基本規(guī)整呈圓形，顏色正常，未見明顯軟骨剝脫或表面粗糙。

2.2 X線片觀察

A組10只標(biāo)本骨折線模糊，內(nèi)固定物未見松動(dòng)，有2只股骨頭內(nèi)可見點(diǎn)片狀密度增高影，5只股骨頭軟骨下可見不同程度小囊樣變，骨質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂。B組10只標(biāo)本骨折線模糊，頭頸外形正常，內(nèi)固定物未見松動(dòng)，有5只股骨頭軟骨下可見囊狀透光區(qū)，骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂。C組10只標(biāo)本骨折線模糊，頭頸外形正常，內(nèi)固定物未見松動(dòng)，軟骨下未見囊樣變，1只股骨頭可在軟骨下發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)狀疏松。D組10只標(biāo)本骨折線模糊，頭頸外形正常，內(nèi)固定物未見松動(dòng)，軟骨下未見囊樣變或骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂。見表1。

說明定制的空心螺釘能牢固固定骨折端，滿足穩(wěn)定骨折端的技術(shù)要求，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)術(shù)后不限制實(shí)驗(yàn)犬的活動(dòng)，并不影響骨的愈合。

表1 各組股骨頭缺血性壞死例數(shù)（經(jīng)影像學(xué)檢查）

圖2 造模術(shù)后20周X線片（左髖D組、右髖A組）

2.3 HE染色結(jié)果

A組標(biāo)本骨小梁可見部分中斷，髓腔內(nèi)充滿肥大的脂肪細(xì)胞,骨細(xì)胞核消失,空骨陷窩明顯增多（圖3）。B組標(biāo)本骨小梁萎縮、稀疏，骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞大小不均勻?？梢姽羌?xì)胞核固縮、邊聚，有較多空的骨陷窩（圖4）。C組標(biāo)本骨小梁排列較不規(guī)則,骨細(xì)胞大部分正常,有較多脂肪細(xì)胞,空骨陷窩可見（圖5）。D組標(biāo)本骨小梁排列規(guī)則、整齊，骨細(xì)胞清晰，骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞分布均勻，空骨陷窩偶見（圖6）。

從大體標(biāo)本、X線表現(xiàn)和病理切片我們可以得出結(jié)論：通過股骨頸截骨再固定的方法，造成了了創(chuàng)傷性的股骨頭缺血性壞死，說明①本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)傷性股骨頭缺血壞死造模成功；②空心螺釘固定能為骨質(zhì)愈合創(chuàng)造良好條件，但并不能減少股骨頭壞死的發(fā)病率；③X線平片對(duì)于股骨頭缺血性壞死的診斷敏感性較低、有漏診可能。見表2。

表2 各組股骨頭缺血性壞死例數(shù)（經(jīng)病理學(xué)檢查）

圖3 A組標(biāo)本病理學(xué)檢查（×200） 圖4 B組標(biāo)本病理學(xué)檢查（×200）

圖5 C組標(biāo)本病理學(xué)檢查（×200） 圖6 D組標(biāo)本病理學(xué)檢查（×200）

免疫組化染色

A、B組標(biāo)本骨小梁表面的少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)VEGF陽性表達(dá)，染色較淡且稀疏（圖7、8）；C、D組可見骨小梁表面著色較深，且陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量多，髓內(nèi)出現(xiàn)大量陽性褐色顆粒（圖9、10）。

圖7 A組標(biāo)本免疫組化染色（×200） 圖8 B組標(biāo)本免疫組化染色（×200）

圖9 C組標(biāo)本免疫組化染色（×200） 圖10 D組標(biāo)本免疫組化染色（×200）

2.4 血管計(jì)數(shù)

通過Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)免疫組化切片進(jìn)行光密度測(cè)量，從而得出各組標(biāo)本血管計(jì)數(shù)（表3）。A組血管計(jì)數(shù)水平最少，B組血管計(jì)數(shù)較A組多，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。D組、C組血管計(jì)數(shù)較A組、B組明顯增加，且有極顯著差異（P＜0.01），說明轉(zhuǎn)染VEGF的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞確實(shí)起到了再生血管，加速骨修復(fù)的作用。D組和C組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，有顯著差異（P＜0.05），證明骨內(nèi)的微應(yīng)力直接作用，能夠進(jìn)一步促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成血管功能。

表3 各組血管計(jì)數(shù)結(jié)果（）

表3 各組血管計(jì)數(shù)結(jié)果（）

組別 例數(shù)（個(gè)） 血管計(jì)數(shù)（個(gè)）A組 10 9.12±1.41 B組 10 11.78±2.55 C組 10 26.22±2.13 D組 10 35.81±2.45

2.5 Western Blot檢測(cè)各組VEGF蛋白表達(dá)

用Western Blot蛋白印跡法分析各組VEGF蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：四組股骨頭組織中均檢測(cè)出有VEGF蛋白的表達(dá)，其中D組表達(dá)量最高，較C組有顯著性差別（P＜0.05），較A、B組有極顯著性差別（P＜0.01）。A組表達(dá)量少，和B組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。C組和A、B組有顯著性差別（P＜0.05）。說明轉(zhuǎn)染VEGF的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞相較與單純內(nèi)固定而言促進(jìn)血管的再生和修復(fù)，而適當(dāng)?shù)墓莾?nèi)應(yīng)力能加速這種修復(fù)作用。見表4。

表4 各組股骨頭VEGF蛋白表達(dá)

圖11 Western blot檢測(cè)各組VEGF蛋白表達(dá)

3 討 論

和非創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，學(xué)說較多不同，創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機(jī)制相對(duì)清楚。比較一致的觀念認(rèn)為：股骨頸骨折后造成股骨頭血供的中斷，血液循環(huán)障礙是導(dǎo)致股骨頭缺血壞死的根本原因。而在修復(fù)過程中，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)吸收往往超過新骨形成的速度，造成骨密度降低，削弱了股骨頭的承重能力，從而在應(yīng)力作用下發(fā)生塌陷。即創(chuàng)傷性股骨頭壞死是生物學(xué)因素與生物力學(xué)因素共同作用的結(jié)果。其病理生理學(xué)基礎(chǔ)在于：①新生血管形成障礙，局部血液供應(yīng)不足；②骨組織損傷壞死或/和新生骨形成能力低下。

生物力學(xué)在創(chuàng)傷性股骨頭壞死方面的研究越來越深入。Wolf定律提示我們，任何骨組織的修復(fù)與重建都是和其所承受的載荷密切關(guān)聯(lián)的。Mannl等[3]發(fā)現(xiàn)機(jī)械應(yīng)力刺激可以促進(jìn)新骨的生成活力。另外縱向載荷產(chǎn)生的壓應(yīng)力對(duì)壞死股骨頭的修復(fù)極為重要，它可以驅(qū)動(dòng)軟骨基質(zhì)礦化和MSCs向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞方向分化，刺激成骨細(xì)胞的功能活性，提高骨密度，有助于骨的改建[4,5]。國內(nèi)作者發(fā)現(xiàn)，股骨頭塌陷與松質(zhì)骨及軟骨下骨生物力學(xué)特性關(guān)系密切，軟骨下骨的生物力學(xué)強(qiáng)度在股骨頭塌陷時(shí)下降較松質(zhì)骨顯著，是股骨頭塌陷的關(guān)鍵因素[6]。因此我們?cè)O(shè)想，除了體外通過改變自體負(fù)重來達(dá)到影響股骨頭修復(fù)的目的外，可否直接從體內(nèi)構(gòu)建一個(gè)能進(jìn)行骨內(nèi)應(yīng)力傳導(dǎo)的腔室，這樣可以在治療骨折的同時(shí)即對(duì)可能發(fā)生的股骨頭壞死進(jìn)行干預(yù)？通過對(duì)臨床常用的空心加壓螺釘進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，結(jié)合彈簧的加壓，我們構(gòu)建了一個(gè)簡單但加壓持續(xù)可靠的骨內(nèi)加壓裝置。從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果看，骨內(nèi)加壓裝置起到了3個(gè)方面的效用：①牢固固定骨折斷端，為良好的骨愈合創(chuàng)造了條件；②可以力點(diǎn)準(zhǔn)確的對(duì)軟骨下骨進(jìn)行適當(dāng)加壓，為軟骨下骨提供了進(jìn)一步的支撐；③給腔內(nèi)填塞的MSCs施以一定的縱向壓力，促進(jìn)了成骨和成血管過程，有利于骨折后股骨頭的再生和修復(fù)。

中青年股骨頸骨折患者多由高能量創(chuàng)傷引起，且常伴有多發(fā)性損傷，相較老年患者而言，股骨頭壞死及骨不連的發(fā)生率較高。股骨頸骨折往往造成股骨頭血管血供的中斷，尤其是在有移位的情況下，這是造成創(chuàng)傷性股骨頭壞死的根本原因 。股骨頸骨折后，骨折近端血供破壞.需依靠骨折遠(yuǎn)端的新生血管通過爬行進(jìn)入股骨頭，使之復(fù)活并新生骨，這一修復(fù)速度大概需7～8個(gè)月才能完成。組織學(xué)觀察表明，股骨頸骨折后，有85%發(fā)生股骨頭缺血壞死，然后經(jīng)過再血管化、恢復(fù)血供、股骨頭復(fù)活[7]。顯然，由于股骨頸骨折后股骨頭組織局部普遍存在血供不足和微循環(huán)障礙等問題，因此促進(jìn)血管再生的治療策略應(yīng)有助于骨損傷修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)選擇了能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性的血管內(nèi)皮生長因子作為細(xì)胞因子，將VEGF基因通過分子生物學(xué)方法轉(zhuǎn)染入MSCs中，使其能夠穩(wěn)定長期的表達(dá)，為股骨頭內(nèi)血管的再生和修復(fù)提供良好的保證。由于MSCs強(qiáng)大的分化潛能和增殖能力，使轉(zhuǎn)染了VEGF基因的MSCs具有了更好的修復(fù)能力，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明：填入復(fù)合VEGF基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的股骨頭在造模20周后VEGF的含量和血管的計(jì)數(shù)均高于單純螺釘內(nèi)固定組，說明轉(zhuǎn)染后的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠穩(wěn)定的表達(dá)VEGF，促進(jìn)了血管的新生，從而很好的避免了股骨頭的壞死塌陷。

本次實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了通過骨內(nèi)縱向加壓促進(jìn)了頭內(nèi)血管的再生和骨壞死的修復(fù)，獲得了滿意的效果。但是不足之處在于：沒有測(cè)定釘頭加壓后對(duì)股骨頭內(nèi)壓有何影響？是否會(huì)加重骨內(nèi)高壓反而造成股骨頭缺血性壞死的出現(xiàn)或加重？骨內(nèi)高壓是由于骨內(nèi)靜脈回流受阻，靜脈淤滯，組織水腫而造成內(nèi)壓的增高，組織的壞死。從理論上分析，螺釘釘?shù)纼?nèi)的縱向加壓，壓力方向?yàn)獒斘仓玲旑^，局限于釘孔內(nèi)，不影響頭內(nèi)的血運(yùn)，因而不會(huì)加重骨內(nèi)壓的發(fā)生。當(dāng)然，這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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Vascular Endothelial Growth Factor Gene-modified Mesenchymal Stemcells for the Treatment of Traumatic Osteonecrosis of the Femoral Head in Internal Stress Environment of Bone

HUANG Tao1, TAO Jie2, ZHOU Zi-hui2, ZHOU Yuan1, SONG Deng-xin1, FU Yan-fei3
(1 Department of Orthopedic, Baoshan Branch of Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200940, China; 2 Department of Orthopedic, Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200080, China; 3 Department of Radiology, Baoshan Branch of Shanghai First People's Hospital, Shanghai 200940, China)

ObjectiveTo explore the effects of internal stress of bone on vascular endothelial growth factor gene-modified mesenchymal stem cells in repairing traumatic avascular necrosis of the femoral head in canine models.MethodsDesign and makethe hollow screws that can be intraosseous pressure,mesenchymal stem cell culture andVEGF-gene transfected.Animal model was set up by the femoral neck osteotomy.20 dogs were divided into 4 groups: Group A is the femoral neck fixating by hollow screw only; Group B is the femoral neck fixating by hollow screwand artificial bone; Group C is the femoral neck fixating by hollow screwand artificial bone composited VEGF transfected mesenchymal stem cells; Group D is the femoral neck fixating by hollow screwand artificial bone composited VEGF transfected mesenchymal stem cells,meanwhile, compressedscrew.After 20 weeks, repair effect of bone and blood vessel was determined by methods including Immunohistochemical technique, image analysis and Western blotting.ResultThe animal model of traumatic avascular necrosis of the femoral head was successfully produced through the operation.As shown in immunohistochemical techniqueand western blotting, Vessel count and VEGF-protein content, the Group D were significantly higher than the other three groups(P＜0.05), the Group C were higher than the Group Aand the Group B(P＜0.05)but lower than the Group A.There was no significant difference between the group A and the group B(P＞0.05).ConclusionIntraosseous pressure can significantly improve revascularization with the VEGF transfected mesenchymal stem cells on traumatic avascular necrosis of the femoral head.Appropriate stress stimulation to necrotic femoral head can speed up the repair of the bone.

Femoral head necrosis; Stress; Mesenchymal stem cells; Vascular endothelial growth factor; Repair

R68

B

1671-8194（2014）22-0078-04

上海市衛(wèi)生局科技發(fā)展基金項(xiàng)目（編號(hào)：2009229）